Autor: dipl. ing. Dušica Ivanov
Mentor: prof. dr Nikola Marjanović

Analitika masnih kiselina široko se primenjuje u prehrambenoj industriji, biohemijskim i medicinskim ispitivanjima. Na osnovu dobijenih rezultata definiše se kvalitet sirovina i gotovih proizvoda, zatim tehnološki procesi i dobijaju podaci o metabolizmu masti, kao i njihovom uticaju da zdravlje.

Analitičke metode koje se koriste, dele se u četiri grupe:

1) senzorne
2) hemijske
3) biohemijske
4) instrumentalne

Senzorne metode se najčešće koriste da bi se ocenio kvalitet proizvoda (ili njegova promena), ili prijatnost, tj. prihvatljivost namirnice. Ocenu kvaliteta obavljaju obučeni stručnjaci, dok se prijatnost ocenjuje od strane potrošača [22].

Hemijske metode imaju trostruki značaj. Prvenstveno se koriste za pogonsku kontrolu, zbog čega je veliki broj svrstan u standardne metode propisane našim i internacionalnim (ISO) standardima. Dalje, one predstavljaju osnovu za primenu instrumentalnih metoda i na kraju, koriste se za pripremu uzoraka koja prethodi analiziranju željenog materijala.

Biohemijske metode obavljaju se in vivo (u živo), kada se u analizi koriste kompletni organizmi, ili in vitro (u staklu, epruveti), kada se koriste izolovani enzimi.

Instrumentalne metode imaju specifičan značaj u analitici, s obzirom da daju potpuni uvid u sastav i sadržaj pojedinih masnih kiselina u mastima [22].

Potpuna determinacija sadržaja masnih kiselina podrazumeva kako kvalitativne, tako i kvantitativne analize. Tehnike se najčešće kombinuju, da bi se dobili pouzdani podaci. U analitici trans masnih kiselina najrasprostranjenije su hromatografske i spektroskopske metode. Od hromatografskih metoda koriste se gasna, visokopritisna tečna hromatografija (HPLC) na obrnutim fazama i hromatografija sa adsorbensom impregniranim srebrnim jonima (Ag⁺ hromatografija), izvedena kao tankoslojna (TLC), HPLC, ili kolonska sa niskim pritiskom. Od spektroskopskih metoda u upotrebi su klasična infracrvena (IR) spektroskopija, kao i novije tehnike IR, FTIR (Fourier Transform InfraRed), Ramanove, UV i NMR spektroskopije [7, 23, 24].

Tehnikom HPLC na obrnutim fazama postiže se dobro razdvajanje geometrijskih i nekih pozicionih izomera masnih kiselina. Osnovni problem kod razvoja ovih uređaja je odabir odgovarajućeg detektora. Pri analizi realnih uzoraka, može doći do preklapanja pikova, naročito ako su u pitanju kompleksne smeše sa velikim brojem komponenata. HPLC na obrnutim fazama koristi se i za pripremu uzoraka pre upotrebe kapilarne GC [24].

Ag+ hromatografija se bazira na specifičnoj osobini nezasićenih organskih jedinjenja da grade komplekse sa prelaznim metalima, u ovom slučaju sa srebrom [25]. Kompleksi su jonoizmenjivačkog tipa, npr. nezasićeno jedinjenje je donor, a srebrni jon akceptor elektrona. Prilikom razdvajanja masnih kiselina, primećuje se da cis izomeri grade stabilnije komplekse, nego trans forrmacije. Ako se posmatra i dužina lanca, stabilnost kompleksa raste po sledećem redosledu:

zasićene < trans 22:1 < trans 20:1 < trans 18:1 < cis 22:1 < cis 20:1 < cis 18:1

Mnogo godina je Ag+ TLC bila jedna od osnovnih separacionih tehnika u analizi masti. TLC je brza, jednostavna i može se primeniti na raznovrsne analite, a ne zahteva skupe instrumente [26]. Ploče za hromatografisanje se pripremaju ili industrijski, ili u sopstvenim laboratorijama. Najčešći način izvođenja TLC je upotrebom adsorbensa impregniranog srebrnim solima. Da bi se postigla dobra rezolucija, sadržaj AgNO3 treba da iznosi od 20 do 30 %. Praktično, to je vrlo teško izvesti, jer su takve ploče osetljive na svetlost, što sprečava detekciju komponenata razdvajane smeše. Danas se najviše upotrebljavaju ploče sa 5 do 20 % AgNO3 u adsorbensu, a dobri rezultati u razdvajanju metil-estara masnih kiselina i triglicerida postižu se potapanjem ploča u 0,5 % metanolni rastvor AgNO3. Pri izvođenju hromatografisanja treba voditi računa i o drugim varijablama, kao što su vlažnost vazduha, temperatura sušenja ploča, temperatura razvijanja hromatograma i druge [26].

Ag+ HPLC je kolonska tehnika hromatografisanja. Osnovni problem koji se javio prilikom njenog razvoja bila je konstrukcija stabilnog i reproduktivnog sistema sa kontrolisanim sadržajem srebra i relativno dugim rokom upotrebe. Najvažniji deo ovakvog sistema je kolona, koja se, generalno, priprema na dva načina: impregnacijom adsorbensa (najčešće silika gela) solima srebra, ili dodatkom srebrnih jona u jonoizmenjivački medijum. Alternativno se soli srebra mogu dodavati mobilnoj fazi u toku konvencionalne HPLC na obrnutim fazama. Najveći nedostatak kolona sa adsorbensom impregniranim srebro-nitratom je kratak rok upotrebe, zbog tzv. „krvarenja“ (otpuštanja) Ag+ jona. Pojava se delimično prevazilazi korišćenjem pretkolona sa AgNO3, ili njegovom precipitacijom. Srebrni joni se mnogo bolje zadržavaju kada se dodaju jonoizmenjivaču . Vrlo je važan i odabir odgovarajuće mobilne faze. Priroda interakcije između srebrnih jona, analita i mobilne faze nije još uvek u potpunosti razjašnjena. U ovom obliku HPLC od velike važnosti je aceto-nitril, koji gradi stabilne komplekse sa Ag+ jonima, a hlorovani rastvarači, takođe, su se pokazali kao vrlo pogodni. Rastvarači moraju biti visoke čistoće i ne smeju stupati u nepoželjne interakcije sa adsorbensom, ili ispitivanim rastvorom [27].

Uporedo sa TLC tehnikom, razvijala se kolonska Ag+ hromatografija pri niskom pritisku. De Vries [28] je prvi upotrebio hromatografsku tehniku za separaciju metil-estara masnih kiselina i sve današnje izvedbe zasnovane su na istom principu.Tehnika je vrlo slična HPLC, pa je i konstrukcija aparature skoro identična, ali su delovi većih dimenzija, a prmenjeni pritisak kolone je znatno niži, nego kod HPLC [28].

Klasičnom IR spektroskopijom određuju se trans masne kiseline sa izolovanim dvostrukim vezama, s tim da sadržaj TFA u proizvodima koji se analiziraju mora biti veći od 1% u ukupnim mastima. Metoda podrazumeva pripremu metil-estara i snimanje apsorpcionog IR spektra u intervalu od 900 do 1050 cm‾ ¹. Analizi uzorka prethodi definisanje kalibracione krive na osnovu rezultata dobijenih iz apsorpcionih spektara standardnih rastvora metil-elaidata. Interpolacijom površine pika TFA u kalibracionu krivu, određuje se njihov sadržaj [7].

FTIR spektroskopija pokazuje veću tačnost i ne zahteva derivatizaciju uzoraka, a moguća je i automatizacija procesa. Koristi se za rutinske analize komercijalnih proizvoda, naročito za određivanje trans monoena niskog sadržaja (ispod 2%). Greška pri definisanju sastava analita upotrebom ove tehnike značajno je smanjena [29].

U našoj zemlji trans masne kiseline prvi put su ispitivane 1965. godine u biljnim mastima domaće proizvodnje, a 1975. je prvi put određen sadržaj TFA u margarinima domaće proizvodnje na Tehnološkom fakultetu u Novom Sadu [30]. U pomenutoj analizi korištena je metoda IR spektrofotometrije, po Devine-u i Williams-u.

Standardne metode određivanja metil-estara trans masnih kiselina gasnom hromatografijom

S obzirom na dobre rezultate koje je pokazala u analitici, gasna hromatografija se koristi u mnogim standardnim metodama za određivanje trans masnih kiselina. Svaka od ovih metoda podrazumeva prethodnu pripremu metil-estara, kao lakše isparljivih derivata odgovarajućih masnih kiselina. Priprema se takođe izvodi po standardnim metodama, a preporučuju se ISO 5509, AOCS oficijelna metoda Ce 2 66, IUPAC 2.301. [31], ili AOAC 969.33 [32]. Ukoliko se upotrebljava unutrašnji standard, obično je to rastvor C13:0 masne kiseline u hloroformu, koncentracije 5mg/ml [33].

Kolone koje se najčešće koriste mogu se podeliti na: kratke (50, ili 60 m) i duge (100, ili120m) sa visoko polarnom stacionarnom fazom;

– CP-Sil 88, 100, ili 50 m x 0,25 mm prečnik, film 0,25 μm (Chrompack, Middleburg, the Netherlands),
– SP-2560, 10, ili 50 m x 0,25 mm prečnik, 0,20 µm film (Supelco Inc., Bellefonte, PA, USA),
– BPX-70, 120, ili 50 m x 0,22 mm prečnik, 0,25 µm film (SGE, Inc., Austin, TX, USA) [33].

Preporučeni uslovi hromatografisanja dati su u tabeli 5:

Tabela 5: GC uslovi preporučeni standardnom metodom ISO 15304:2002(E)

Ovi uslovi mogu se u praktičnom radu korigovati, da bi se dobilo optimalno razdvajanje pikova. Korekcija temperature izvodi se postepeno, za po jedan stepen Celzijusa [31].

 

Kao gasovi nosači koriste se helijum, azot, ili vodonik (≥ 99,99% čistoće) sa priključenim adsorberom kiseonika. U svim navedenim metodama upotrebljen je slit injektor sa SR odnosom 1:100.

Sadržaj trans izomera izražava se kao maseni udeo sume C18:1 trans, C18:2 trans i C18:3 trans metil estara-masnih kiselima u ukupnim metil-estrima [31]. Relativna masa svake pojedinačne frakcije izračunava se prema formuli :

Wx – relativna masa frakcije komponente x, u % površine pika
Ax – površina pika date komponente u jedinicama površine
At – suma korigovanih površina svih pikova, osim pika rastvarača, u jedinicama površine
fx – korekcioni faktor za komponentu x

Ukoliko se kao detektor koristi FID, nije potrebno korigovati dobijene površine.

Nedostatak metode AOAC 994.15 je što se može primeniti samo na proizvode čiji je sadržaj trans masnih kiselina veći od 5 %.

Priprema uzoraka koji sadrže lipide za gasnu hromatografiju

Da bi se kvalitativno i kvantitativno odredio sastav masnih kiselina u nekom materijalu, masti iz uzorka je potrebno izdvojiti od ostalog medijuma. Ako je sadržaj lipida u materijalu visok, pristupa se ceđenju sirovine i naknadnom presovanju. Kod uzoraka sa manjom količinom masti, nakon operacije sušenja, izvode se različiti vidovi ekstrakcija, u zavisnosti od zahteva analize. Nakon izolovanja, masti se esterifikuju i potom sledi njihova analiza [8, 34].

Klasične tehnike ekstrakcije koje se najčešće primenjuju su: metoda po Soxhlet-u, Folch-u, Röse-Gottlieb-u, Werner-Schmid-u, Mojonnier-u, Weibull-Berntrop-u i Bligh-Dyer-u. Sve ove metode, osim ekstrakcije po Soxhlet-u, zahtevaju alkalnu, kiselu, ili enzimatsku hidrolizu, pre upotrebe rastvarača [35].

Prednost metode po Soxlet-u je to što ne zahteva prethodnu hidrolizu, a mane su dugo vreme izvđenja (16-24 h) i povišena temperatura ekstrakcije, usled koje dolazi do promene u strukturi masti, pa time i do grešaka u dobijenim rezultatima, naročito u specifičnim analizama, kakva je analiza trans masnih kiselina. Kao rastvarači obično se koriste bezvodni petrol-etar, heksan, ili benzen [34, 35].

Metoda po Folchu ne zahteva ekstremne uslove rada, tj. odvija se na sobnoj temperaturi i atmosferskom pritisku, što je i njena najveća prednost, jer ne izaziva promene u ispitivanim mastima. Kao rastvarač se koristi smeša hloroform/metanol (2:1 v/v). Jedini nedostatak koji se javlja je dugo vreme ekstrakcije (150 do 270 min.) u zavisnosti od vrste uzorka. Isparavanje rastvarača se odvija u struji azota, da bi se sprečila oksidacija masti atmosferskim kiseonikom [35, 36, 37].

U cilju skraćenja postupka pripreme uzoraka, od skoro se ispituju nove metode, koje su brže, a ne pokazuju negatvne promene na ispitivanom materijalu. Takve su, na primer, ekstrakcija po Soxlet-u potpomognuta usmerenim mikrotalasima (FMASE), koja traje između 35 i 60 minuta i dinamična ekstrakcija potpomognuta ultrazvukom (DUAE), čije je vreme izvođenja od 70 do 140 minuta [35, 36, 37].

Ekstrakcija nadkritičnim fluidima (SFE) i ekstrakcija u zatvorenom sistemu na visokoj temperaturi i pritisku (PTE) takođe se mogu koristiti za ubrzavanje porcesa. Druga pomenuta metoda zahteva ekstremne uslove rada, što izaziva promene u strukturi lipida, pa se ne preporučuje [38].

Spisak korišćene literature možete naći u Literatura – Analiza hrane.