Autor: dipl. biolog – master Vladimir Vukić
E-mail: vladimirvukic@gmail.com
.
.
Uvod
Ispravnost životnih namirnica je esencijalna za zdravlje potrošača. Zbog toga se mora vršiti njihova stroga kontrola kvaliteta. Namirnice mogu biti neispravne usled neispravnih sirovina, greške u proizvodnji (tehnologija proizvodnje, zagađenje neorganskom ili organskim jedinjenjima, kontaminacija mikroorganizmima) ili dugog stajanja pre upotrebe (umnožavanje mikroorganizama). Porastom trgovine i uvoza prehrambenih proizvoda, produžava se vreme transporta namirnica do krajnjih potrošača, a time i povećava mogućnost razvoja nepoželjnih mikroorganizama.
U ovom seminarkom radu će biti obrađena mikrobiološka kontrola ispravnosti mleka i mlečnih proizvoda.
Pod mlekom, u širem smislu reči, podrazumeva se tečnost bele boje, specifičnog mirisa i ukusa, koju izlučuje mlečna žlezda izvesno vreme posle partusa ženki sisara i koja služi za ishranu mladunaca. Mleko različitih vrsta sadrži iste komponente, ali njihov međusobni odnos može biti veoma različit (Đorđević, 1982).
Sastav mleka zavisi od mnogih faktora (vrsta, rasa, period laktacije, ishrana i dr.). Prosečan hemijski sastav mleka domaćeg govečeta je sledeći (www.tehnologijahrane.com):
- voda – 87,5 %,
- proteini (kazein, proteini surutke) – 3,13 %,
- ugljeni hidrati (laktoza) – 4,84 %,
- masti 3,76 %,
- mineralne materije (mikro i makro elementi) – 0,8 %,
- gasovi (CO2, O2, N2),
- ostali sastojci (vitamini, enzimi, ostale azotne materije).
.
Mikrobiološki pregled mleka
Zbog svog sastava mleko predstavlja veoma pogodnu podlogu za razvoj mikroorganizama, među kojima mogu biti patogeni za čeveka. Nakon muže mleko sadrži oko 1000 mikroorganizama u 1 ml. Vremenom se njihov broj uvećava, i usled njihovog metabolizma menjaju se senzorna, fizička i hemijska svojstva mleka. Kao kontaminanti mleka najčešće se navode mikrokoke (Micrococcus, Staphylococcus), fekalne enterokoke (Enterococcus facalis), enterokoke mastitisa (Enterococcus. agalictiae, E. dysgalactiae), asporogene i sporogene grampozitivne štapićaste bakterije (Microbacterium, Corynebacterium, Arthobacter, Kurthia, Bacillus) i asporogene gramnegativne bakterije (Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Enterobacter, Klebsiella, Escherichia, Serratia, Alcaligenes).
S obzirom da su mnogi mikroorganizmi prisutni u mleku štetni za čoveka, Pravilnikom o mikrobiološkoj ispravnosti namirnica u prometu, propisane su obavezne mikrobiološke analize mleka („Sl. List SRJ“, br. 26, 1993):
- Određivanje ukupnog broja bakterija u 1 ml ili 1 g,
- Izolovanje i identifikaciju vrsta roda Salmonella,
- Izolovanje i identifikaciju koagulaza pozitivnih stafilokoka,
- Izolovanje i identifikaciju vrsta roda Proteus,
- Izolovanje i identifikaciju E. coli,
- Izolovanje i identifikaciju sulforedukujućih bakterija.
Mikrobiološkom kontrolom je obuhvaćeno:
- Sirovo mleko,
- Sterilizovano mleko,
- Pasterizovano mleko dok se nalazi u mlekari,
- Pasterizovano mleko u času prodaje potrošačima,
- Mleko u prahu,
- Zgusnuto zaslađeno mleko,
- Zgusnuto zaslađeno obrano mleko,
- Zgusnuto nezaslađeno mleko,
- Zgusnuto nezaslađeno obrano mleko.
.
Uzimanje uzoraka i priprema razređenja
Način uzimanja uzoraka zavisi od načina pakovanja, koji se razlikuje pri otkupu, proizvodnji i prodaji potrošačima. Uzorci se uzimaju u aseptičkim uslovima, i moraju biti reprezentativni za celokupnu količinu mleka. Ako se mleko nalazi u cisternama ili kantama, uzorci se uzimaju sterilnim priborom i pakuju se u sterilne, suve posude i potrebno je uzeti najmanje 200 ml. Uzorci se moraju ispitati u roku 24 sata. Ukoliko se mleko nalazi u originalnom pakovanju, uzima se jedno pakovanje ili najmanje 500 ml. Ukoliko je pakovanje male mase, uzimaju se uzorci ukupne mase 100 g.
S obzirom da mleko može biti kontaminirano mikroorganizmima u većem stepenu, potrebno je napraviti odgovarajuća razblaženja. Osnovno razblaženje je 1:10.
.
Određivanje ukupnog broja mikroorganizama u 1 ml ili 1 g
– Direktan (neposredan) metod
Ovaj metod podrazumeva direktno brojanje ćelija u razmazu mleka pod mikroskopom.
Sterilnom mikropipetom se nanese 0,01 ml uzorka na pločicu sa ucrtanim kvadratom površine 1 cm2. Preparat se boji prostim bojenjem (metilensko plavo) i posmatra pod mikroskopom (imerzioni objektiv). Nedostatak ovog metoda je što se broje i žive i mrtve ćelije, što stvara grešku u proceni stepena kontaminiranosti uzorka.
– Indirektan (posredan) metod
Princip metoda je pretpostavka da jedna ćelija obrazuje jednu koloniju. Da bi se ispunio ovaj preduslov, moraju se koristiti određena razređenja.
U ovom postupku 1 ml odgovarajućeg razređenja se otpipetira u sterilnu Petri ploču i prelije sa 15 ml otopljene i na 45 oS ohlađene podloge za ukupan broj bakterija. Radi preciznosti rezultata, zasejavanje se vrši u tri ponavljanja. Inkubacija se vrši na 30 oS u toku 72 sata, a za brojanje se odabiraju ploče sa 30 do 300 kolonija. Broje se sve izrasle kolonije. Dobijeni broj se množi faktorom razblaženja i time se dobija broj bakterija u 1 ml.
– Određivanje ukupnog broja bakterija utvrđivanjem vremena redukcije (reduktaza ogled).
U sterilnu epruvetu se otpipetira 10 ml mleka i doda 5 ml 0,01 % vodenog rastvora metilenskoplavog. Zapušena epruveta se stavi u vodeno kupatilo na temperaturu od 37 oS i prati vreme potrebno da se sadržaj obezvboji. Smatra se da je mleko kontaminirano nedozvoljenim brojem bakterija ako je 4/5 uzoraka mleka obezbojeno u vremenu kraćem od dva sata. Prilikom očitavanja rezultata, gornji sloj mleka u visini od 1-2 mm treba zanemariti jer može doći do obezbojenja usled oksidacije iz vazduha (Škrinjar, 2001).
Izolovanje i identifikacija vrsta roda Salmonella
Vrste roda Salmonella ne smeju se nalaziti u 25 ml svih vrsta mleka i napitaka od mleka, niti u 25 g mleka u prahu. Izolovanje i identifikacija salmonela iz mleka su dati u poglavlju 5.3.
Izolovanje i identifikacija koagulaza pozitivnih stafilokoka
Koagulaza pozitivne stafilokoke ne smeju se nalaziti u 0,01 ml sirovog mleka, niti u 1 ml pasterizovanog mleka u originalnom pakovanju dok se nalazi uskladišteno u mlekari, niti u 1 ml zgusnutog zaslađenog, niti zgusnutog zaslađenog obranog mleka, niti u 0,1 g mleka u prahu. Izolovanje i identifikacija koagulaza pozitivnih stafilokoka iz mleka su dati u poglavlju 5.5.
Izolovanje i identifikacija vrsta roda Proteus
Nalaz roda Proteus ukazuje na fekalnu kontaminaciju uzorka.
Vrste roda Proteus ne smeju se nalaziti u 0,001 ml sirovog mleka, niti u 1 ml pasterizovanog mleka u originalnom pakovanju dok se nalazi uskladišteno u mlekari, niti u 1 ml zgusnutog zaslađenog niti zgusnutog zaslađenog obranog mleka, niti u 0,1 g mleka u prahu. Izolovanje i identifikacija roda Proteus iz mleka su dati u poglavlju 5.4.
Izolovanje i identifikacija E. coli
E. coli ne sme se nalaziti u 0,001 ml sirovog mleka, sterilisanog mleka i sterilisnih mlečnih proizvoda. Pasterizovano mleko u originalnom pakovanju dok se nalazi uskladišteno u mlekari ne sme sadržati E. soli u 1 ml, niti u 1 ml zgusnutog zaslađenog niti zgusnutog zaslađenog obranog mleka. Ne sme se nalaziti u 0,1 ml pasterizovanog mleka i mlečnih proizvoda u trenutku prodaje potrošačima niti u 0,1 g mleka u prahu.
Izolovanje i identifikacija E. coli iz mleka su dati u poglavlju 5.2.
Izolovanje i identifikacija sulforedukujućih klostridija
Sulforedukujuće klostridije ne smeju se nalaziti u 0,01 ml sirovog mleka, sterilizovanog mleka i mlečnih proizvoda, 1 ml pasterizovanog mleka u originalnom pakovanju dok se nalazi uskladišteno u mlekari, niti u 1 ml zgusnutog zaslađenog niti zgusnutog zaslađenog obranog mleka, niti u 0,01 g mleka u prahu. Izolovanje i identifikacija sulforedukujućih klostridija iz mleka su dati u poglavlju 5.6.
Određivanje broja aerobnih mezofilnih sporogenih i aerobnih termofilnih sporogenih ibakterija u 1 ml
Postupak za oderđivanje broja aerobnih mezofilnih sporogenih bakterija dat je u poglavlju 5.7, a za oderđivanje broja aerobnih termofilnih sporogenih bakterija u poglavlju 5.8.
.
Mikrobiološki pregled fermentisanih mlečnih proizvoda
Fermentisani mlečni proizvodi se proizvode širom sveta pod raznim imenima. U Evropi su najčešći: jogurt, kiselo mleko, acidofilno mleko i kefir.
Fermentisani mlečni proizvodi nastaju radom mikroorganizama (starter kultura) koji fermentišu laktozu. U zavisnosti od vrste mikroorganizama razlikuju se krajnji produkti fermentacije. Uglavnom je to mlečna kiselina, ali može biti i sirćetna kiselina, etanol i CO2 kao što je slučaj kod kefira. U toku fermentacije snižava se pH što produžava rok trajanja proizvoda. Mlečna kiselina podstiče peristaltiku creva i poboljšava resorpciju kalcijuma i fosfora. Karakterističan izgled i aromu daju nastali acetaldehid i diacetil (Koprivica, 2008). Kao starter kulture koriste se:
| Proizvod | Starter kultura |
| Jogurt | Enterococcus thermophilus |
| Lactobacillus delbruecki ssp. bulgaricus | |
| Lactobacillus lactis | |
| Acidofilno zrno | Lactobacillus acidophylus |
| Kefir | Kefirno zrno: |
| Lactobacillus lactis ssp. lactis | |
| Candida kefir | |
| Lactobacillus acidophylus | |
| Lactobacillus casei |
Iako snižen pH inhibira rast većeg broja štetnih mikroorganizama, pojedini mikroorganizmi mogu rasti u tim uslovima.
Uzimanje uzoraka i priprema razređenja
Uzimanje uzoraka za mikrobiološke analize se izvodi na isti način kao kod mleka. Pravilnikom o mikrobiološkoj ispravnosti namirnica u prometu propisane su obavezne mikrobiološke analize fermentisanih mlečnih proizvoda („Sl. List SRJ“, br. 26, 1993):
Izolovanje i identifikacija E. coli
Kiselo mleko, jogurt, kefir i drugi fermentisani mlečnokiseli proizvodi ne smeju sadržati E. coli u 0,1 ml dok se nalaze u mlekari, niti u 0,01 ml u trenutku prodaje potrošačima. Izolovanje i identifikacija E. coli iz mleka su dati u poglavlju 5.2.
Izolovanje i identifikacija vrsta roda Proteus
Kiselo mleko, jogurt, kefir i drugi fermentisani mlečnokiseli proizvodi ne smeju sadržati Proteus u 0,1 ml dok se nalaze u mlekari, niti u 0,01 ml u trenutku prodaje potrošačima. Izolovanje i identifikacija roda Proteus iz mleka su dati u poglavlju 5.4.
Izolovanje ui identifikacija koagulaza pozitivnih stafilokoka
Kiselo mleko, jogurt, kefir i drugi fermentisani mlečnokiseli proizvodi ne smeju sadržati koagulaza pozitivne stafilokoke u 0,1 ml dok se nalaze u mlekari. Izolovanje i identifikacija koagulaza pozitivnih stafilokoka iz mleka su dati u poglavlju 5.5.
Izolovanje ui identifikacija vrsta roda Salmonella
Salmonele se ne smeju nalaziti u 25 ml fermentisanih mlečnih proizvoda. Izolovanje i identifikacija salmonela iz mleka su dati u poglavlju 5.3.
Izolovanje i identifikacija sulforedukujućih klostridija
Kiselo mleko, jogurt, kefir i drugi fermentisani mlečnokiseli proizvodi ne smeju sadržati koagulaza pozitivne stafilokoke u 0,1 ml dok se nalaze u mlekari, niti u 0,01 ml u trenutku prodaje potrošačima. Izolovanje i identifikacija sulforedukujućih klostridija iz mleka su dati u poglavlju 5.6.
.
Mikrobiološki pregled sira
Kazeinski (obični) sir nastaje koagulacijom kazeina u mleku usled dodatka enzima za koagulaciju. Takođe, od nastale surutke može se proizvesti sir inkubiranjem na visokoj temperaturi (sir od surutke). Različiti tipovi sireva nastaju pod uticajem različitih sojeva mikroorganizama koji se dodaju kao starter kulture u procesu proizvodnje (Lactococcus lactis, L. thermophilus, L. delbruecki).
Sir predstavlja pogodnu podlogu za razmnožavanje različitih saprofitnih, pa i patogenih mikroorganizama. Stepen kontaminacije sira zavisi od kvaliteta mleka od koga je napravljen, sastava i konzistencije sira, građe, načina i uslova proizvodnje. Takođe, veoma važnu ulogu ima i higijena uređaja i opreme za proizvodnju, higijena radnika, mikrobiološki sastav vazduha, kao i higijenska ispravnost vode.
Na osnovu konzistencije, građe i sadržaja vode, kao i vremena zrenja, sirevi se dele na: tvrde, polutvrde, meke, sveže i sirne namaze. Tvrdi sirevi sazrevaju ujednačeno kroz celu masu. Zreo tvrdi sir nije podložan kvarenju pod uticajem mikroorganizama. Mikroorganizni koji učestvuju u procesu zrenja mekih sireva razvijaju se na površini, dok njihovi produkti difunduju ka unutrašnjosti i izazivaju karakteristične promene (Škrinjar, 2001).
Uzimanje uzoraka i priprema razređenja
Način uzimanja uzorka zavisi od vrste i pakovanja sira. Kod manjih pakovanja uzimaju se originalna pakovanja. Ukoliko se radi o većim koturima sira uzorci se uzimaju sterilnim nožem ili bušenjem sondom. Kod tvrdih i polutvrdih sireva površinski sloj se skida sterilnim nožem i uzorak se uzima iz dubine. Kod belih sireva koji se nalaze u kantama, uzorak se uzima sterilnom kašikom sa površine, iz sredine i sa dna. Masa uzorka treba da bude najmanje 200 g.
Od uzorka sira se odmeri 20 g i usitnjava sterilnim tučkom uz postepeno dodavanje 180 ml 2 % rastvora natrijum-cirtata, zagrejanog na 45 oS. Time se vrši emulgovanje uzorka i dobija osnovno razređenje 1:10.
Pravilnikom o mikrobiološkoj ispravnosti namirnica u prometu propisane su obavezne mikrobiološke analize sira („Sl. List SRJ“, br. 26, 1993):
Određivanje ukupnog broja mikroorganizama u 1 g
U 1 g topljenog sira ne sme se nalaziti više od 10 000 mikroorganizama. Postupak određivanja ukupnog broja bakterija opisan je u poglavlju 2.2.
Izolovanje i identifikacija sulforedukujućih klostridija
Sulforedukujuće klostridije ne smeju se nalazizti u 0,1 g tvrdih i topljenih sireva, niti u 0,01 g polutvrdih sireva. Izolovanje i identifikacija sulforedukujućih klostridija iz mleka su dati u poglavlju 5.6.
Izolovanje ui identifikacija koagulaza pozitivnih stafilokoka
Koagulaza pozitivne bakterije ne smeju se nalazizti u 0,1 g tvrdih i topljenih sireva, niti u 0,01 g polutvrdih sireva. Izolovanje i identifikacija koagulaza pozitivnih stafilokoka iz mleka su dati u poglavlju 5.5.
Izolovanje i identifikacija E. coli
E. coli ne sme se nalaziti u 0,1 g tvrdih i topljenih sireva, niti u 0,01 g polutvrdih sireva. Izolovanje i identifikacija E. coli iz mleka su dati u poglavlju 5.2.
Izolovanje i identifikacija vrsta roda Proteus
Vrste roda Proteus ne smeju se nalazizti u 0,1 g tvrdih i topljenih sireva, niti u 0,01 g polutvrdih sireva. Izolovanje i identifikacija roda Proteus iz mleka su dati u poglavlju 5.4.
Izolovanje i identifikacija vrsta roda Salmonella
Vrste roda Salmonella ne smeju se nalaziti u 25 g svih vrsta mekih, tvrdih i topljenih sireva. Izolovanje i identifikacija salmonela iz mleka su dati u poglavlju 5.3.
Izolovanje i identifikacija lipolitičkih bakterija
Dokazivanje prisustva lipolitičkih bakterija nije obavezno, ali je poželjno zbog njihovog uticaja na organoleptička svojstva sireva. Izolovanje i identifikacija lipolitičkih bakterija iz mleka su dati u poglavlju 5.9.
.
Patogeni mikroorganizmi u mleku i mlečnim proizvodima
.
Koliformne bakterije
Koliformne bakterije se definišu kao štapićaste, gramnegativne, nesporogene bakterije. Mogu biti aerobne ili fakultativno anaerobne i obično imaju sposobnost fermentacije laktoze pri čemu nastaju kiselina i gas, stvaraju enzim β-galaktozidazu i oksidaza negativne su (The microbiology of drinking water, 2002).
U grupu koliformnih bakterija spadaju različiti rodovi enterobakterija. Najčešći kontaminanti životnih namirnica su rodovi iz familije Enterobacteriaceae: Escherichia, Kluyvera, Citrobacter, Klebsiella, i Enterobacter. Ovi rodovi i njihove vrste se međusobno razlikuju po morfološkim i biohemijskim osobinama, kao i po antigenskoj strukturi. Najčešće se za njihovu identifikaciju koristi set od četiri fiziološke reakcije (IMVIC). Ovaj test obuhvata:
- Proveru nastanka indola za vreme razmnožavanja na tečnoj podlozi sa triptofanom pomoću Erliche-ovog ili nekog drugog testa.
- Reakcija metilcrvenog, kojom se ispituje kiselost glukoznog bujona u kome se nalazi bakterija koja ima sposobnost razlaganja glukoze.
- Voges-Proskauer-ova reakcija, kojom se utvrđuje sposobnost produkcije acetil-metil-karbonila u glukoznom bujonu.
- Ispitivanje rasta bakterija na podlozi koja sadrži limunsku kiselinu, ili njene soli, kao jedini izvor ugljenika.
Na IMVIC testu koliformni rodovi daju rezultate prikazane u tabeli 1.
Tabela 1: Rodovi koliformnih bakterija na osnovu IMViC testa
| Rod | Produkcija indola | Reakcija metil-crvenog | Voges-Proskauer-ova reakcija | Korišćenje citrata |
| Escherichia | + | + | – | – |
| Kluyvera | + | + | – | + |
| Citreobacter | v | + | – | + |
| Klebsiella | – | v | v | v |
| Enterobacter | – | – | + | + |
| Serratia | – | – | v | + |
+ = pozitivna reakcija; – = negativna reakcija; v = varijabilno (Škrinjar, 2001)
Takođe, Escherichia se razlikuje od većine drugih koliformnih bakterija po sposobnosti da fermentiše laktozu i na 44 oC (The microbiology of drinking water, 2002).
.
Escherichia coli
Rod Escherichia spada u familiju Enterobacteriaceae i sadrži samo jednu vrstu, Escherichia coli.
E. coli su gramnegativne štapićaste bakterije veličine između 2 i 6 µm. Većina sojeva ima sposobnost kretanja i snadbevena je peritrihijalnim flagelama. E. coli su aerobne i fakultativno anaerobne bakterije, čija optimalna temperatura za razmnožavanje iznosi 37 oS, a mogu rasti i na 44 oS.
E. Coli se odlikuje velikom otpornošću i brzim razmnožavanjem. Može opstati na temperaturama znatno ispod nule, dok je temperature preko 60 oS u trajanju od 15 minuta ubijaju. Osetljiva je na hlor i hlorna jedinjenja, dok je prema antibioticima različito osetljiva (Škrinjar, 2001).
Neki sojevi sintetišu toksična jedinjenja kao što su: enterotoksini (izazivaju kretanje vode iz tkiva u lumen creva, što izaziva dijareju), adhezini (stimulišu adheziju i kolonisanje na površinu crevne mukoze), hemolizini (imaju antigenska svojstva) i endotoksini (Škrinjar, 2001).
E. coli ima veliku fermentativnu i oksidativnu sposobnost, što joj omogućuje rast na svim hranjivim podlogama. Na osnovu razlika u fiziološkim i biohemijskim osobinama E. coli se može diferencirati od drugih rodova famijije Enterobacteriaceae (tab. 2).
Tabela 2: Fiziološke osobine E. coli
| Osobine | Reakcija |
| β-galaktozidaza | + |
| Simons citrat | – |
| Dekarboksilaza | |
| – arginina | v |
| – lizina | + |
| – ornitina | v |
| Likvefakcija želatina | – |
| Oksidacija glukonata | – |
| Produkcija H2S | – |
| Produkcija indola | + |
| Fermentacija metanola | – |
| Razmnožavanje u KCN podlozi | – |
| Pokretljivost | v |
| Reakcija metil-crvenog | + |
| Fenilgrožđana kiselina iz fenilalanina |
– |
| Produkcija ureaze | – |
| Voges-Proskauer-ova reakcija | – |
v = varijabilno (Škrinjar, 2001)
Identifikacija E. coli se vrši inkubacijom 1 ml uzorka na brilijant zelenom žučnom bujonu (ili neke druge pogodne podloge) sa Duramovom epruvetom u toku 24 do 48 sati na 44 oS. Ukoliko dođe do izdvajanja gasa (SO2) i promene boje podloge može se sumnjati na priustvo E. soli. Nakon toga se vrši potvrdni test presejavanjem sadržaja ezom na površinu ljubičasto-crvenog žučnog agara. Inkubacija se ponovo vrši 24 do 48 sati na 44 oS. Pojava karakterističnih ljubičastocrvenih kolonija gram negativnih štapićastih bakterija, predstavnja potvrdu prisustva E. Coli.
U novije vreme se za njenu identifikaciju koriste gotovi, komercijalni testovi. Broj E. coli se utvrđuje zasejavanjem 1 ml razblaženja na selektivnoj podlozi i brojanjem kolonija nakon inkubacije u toku 24-48 sati na 45 oS.
.
Salmonella
Rod Salmonella spada u familiju Enterobacteriaceae.
Salmonele su gramnegativne, štapićaste, asporogene bakterije koje imaju sposobnost kretanja pomoću flagela i fimbrija. Morfološki su ujednačene i slične koliformnim bakterijama. Salmonele su aerobni i fakultativno anaerobni organizmi.
Salmonele spadaju u manje otporne bakterije. Najpogodnije sredine za njihov rast su organski zagađene vode i zemljište. U prehrambenim proizvodima najbolje uspevaju u namirnicama životinjskog porekla.
Osetljive su na hlor, što hlor čini pogodnim dezinfekcionim sredstvom protiv salmonele (hlorisanje vode).
Od toksina, salmonele sintetišu endotoksin i ređe egzotoksin. Iskustva su pokazala da su sve salmonele štetne za čoveka. Najznačajnije oboljenje izazvano salmonelom je crevni tifus. Simptomi su; mučnina, povraćanje, grčevi u stomaku, dijareja. Posle razmnožavanja u crevima, salmonela se može lokalizovati u kostima, zglobovima ili unutrašnjim organima, izazivajući bakteriemiju. Takođe, može doći i do oslobađanja endotoksina nakon razlaganja bakterijskih ćelija u crevima, što dovodi do gastroenteritisa.
Salmonele rastu i raznmožavaju se na svim hranjivim podlogama. Budući da se teško razlikuju od većine enterobakterija, za njihovo izolovanje se koriste različite selektivne podloge. Salmonele produkuju H2S, ne razgradđuju laktozu, saharozu i ureu.
Identifikacija salmonele se vrši prenošenjem 25 g (ml) uzorka u Erlenmajer bocu sa staklenim zrncima i dodavanjem 225 ml podloge za obogaćenje, selenit bujona. Inkubacija se vrši na 37 oS u toku 18-24 časa. Nakon inkubacije ezom ili pipetom se vrši zasejavanje na površinu SS (Salmonella i Shigella) i Wilson-Blair bizmut sulfidnog agara. Inkubacija se vrši na 37 oS u roku od 24-48 sati. Na SS agaru obrazuju se beličaste kolonije, a na Wilson-Blair podlozi rastu u vidu smeđih do crnih kolonija s metalnim sjajem. Nakon toga se boji po Gramu i ako se uoče gramnegativne štapićaste bakterije, vrši se zasejavanje na Klingerov dvostruki šećer, nakon čega se vrši identifikacija skraćenim bohemijskim nizom. To podrazumeva tri zasejavanja na podloge sa ureom, KCN-om i indolom. Inkubacija se vrši na 37 oS u toku 24-48 sati. Salmonela daje sve tri reakcije negativne (Škrinjar, 2001).
.
Proteus
Rod Proteus spada u porodicu Enterobacteriaceae i sadrži više vrsta. U životnim namirnicama najčešće su P. vulgaris i P. mirabilis.
U rod Proteus spadaju štapićaste, gramnegativne nekapsulirane bakterije snadbevene peritrihijalnim flagelama. Spadaju u relativno otporne bakterije. Pri temperaturi od 55 oS, u vlažnim uslovima, umiru u roku od 1 sata. Osetljive su na razna dezinfekciona sredstva, posebno na fenolna i halogenska.
I P. vulgaris i P. mirabilis imaju sposobnost sinteze bakteriocine. Izazivači su sepse, meningitisa i urinarnih infekcija.
Brzo se razmnožavaju na običnim hranjivim podlogama, šire se po površini podloge i stvaraju terasasti pokrivač. Takav oblik kolonije se naziva rojenje. Ova pojava u velikoj meri otežava analizu uzoraka koji sadrže Proteus na prisustvo drugih vrsta. Usled toga, selektivne podloge koje se koriste za identifikaciju drugih vrsta, sadrže inhibitore rasta za vrste roda Proteus.
Za izolovanje vrsta roda Proteus zasejava se 1 g (ml) uzorka na hranjivom bujonu ili na površinu brilijant zelenog agara i inkubira u roku od 24 do 48 sati na 37 oS. Nakon bojenja po Gramu mogu se videti gramnegativne štapićaste bakterije. Izrasle kolonije se zasejavaju na dvostruki šećer po Klingeru i na kraju se vrši identifikacija urea, KCN, fenil-alaninm testom na koje je su vrste roda Proteus pozitivne za razliku od Salmonella-e i Escherichia-e. Identifikacija pojedinih vrsta roda Proteus se može uraditi na osnovu sposobnosti fermentacije pojedinih šećera i drugih biohemijskih svojstava.
.
Staphylococcus
Rod Staphylococcus spada u familiju Micrococcaceae i sadrži više vrsta. Zbog učestalosti pojave u pojedinim životnim namirnicama i oboljenjima koja izaziva, za ljude je najvažnija vrsta S. aureus.
S. aureus su grampozitivne, fakultativno anaerobne, nepokretne, većinom nekapsulirane bakterije loptastog do jajolikog oblika, veličine od 0,8 do 1 µm. Pri razmnožavanju na površini čvrstih podloga, deoba se odvija u tri ili više ravni usled čega nastaju grozdaste nakupine. Na tečnim podlogama obrazuju parove ili kratke lance. Kolonije su obično žućkaste boje.
Sve vrste roda Staphylococcus su veoma otporne bakterije. Na temperaturi od 60 oS mogu izdržati do jednog sata, a mogu neko vreme biti vijabilne i na 80 oS. Veoma su tolerantne na sušu, te mogu opstati i u suvom zemljištu. Sojevi koji nemaju sposobnost produkcije enzima penicilinaze (razgrađuje β-laktamski prsten penicilina) osetljivi su na penicilin. Među najznačajnije ekstracelularne toksine koje luči S. aureus ubrajaju se hemolitički toksini, leukocidin, enterotoksini i epidermolitički toksin. Klinički najvažniji su enterotoksini koji imaju antigenske osobine. Sojevi koji produkuju enterotoksine izazivaju alimentarno oboljenje koje se manifestuje mučninom i dijarejom. S. aureus može izazvati i oboljenja sluznice nosa, grla, sinusa, probavnog i urogenitalnog trakta.
S. aureus je veoma tolerantna na natrijumhlorid, koji inhibira rast većine gramnegativnih i mnogih grampozitivnig bakterija. Zbog toga selektivne podloge za izolovanje stafilokoka sadrže visoke koncetracije natrijumhlorida. Svi sojevi fermentišu glukozu i manitol do kiseline uz izdvajanje gasa.
Identifikacija roda Staphylococcus se vrši zasejavanjem na slanom bujonu za obogaćenje. Nakon toga se zasejava na površinu ETGP podloge po Baird-Parkeru koja usporava rast drugih bakterija, a pospešuje rast koagulaza pozitivnih stafilokoka. Inkubacija se vrši 24 do 48 sati na 37 oS. Kolonije su crne, sjajne i konveksne, prečnika 1 do 5 mm. Oko kolonije se obrazuje prozirna zona usled lioplitičke aktivnosti. Nakon 48 sati inkubacije pojavljuju se tamni prstenovi koji nastaju kao posledica lipolitičke aktivnosti. Nakon toga se vrši provera produkcije koagulaze. U tu svrhu se koristi test koagulaze plazme. Test se izvodi pomoću standarda (poznatog soja koagulaza pozitivnih stafilokoka), ispitivanog uzorka i kontrole. Ikubacija se vrši na 37oS, a rezultati se očitavaju nakon 2, 4, 8 i 24 sata. Pozitivnom reakcijom se smatra ukoliko u prva dva slučaja dođe do potpune koagulacije, dok u trećem dolazi do koagulisanja.
.
Clostridium
Rod Clostridium spada u familiju Bacillaceae i sadrži više vrsta od kojih je za ljude najznačajnija C. perfrigens.
U rod Clostridium spadaju štapićaste, grampozitivne, sporogene bakterije. Neke vrste obrazuju kapsulu. Većina vrsta su saprofiti, žive u vodi, zemljištu i raspadnutim organskim materijama životinjskog i biljnog porekla. Skoro sve vrste su snadbevene flagelama i pokretne su. Položaj spora može biti plektridijalni (na jednom polu) ili (klostridijalni). Na osnovu položaja spora može se vršiti identifikacija vrsta roda Clostridium. Veoma interesantna osobina je gubitak grampozitiviteta u toku kultivisanja.
Većina vrsta su striktni anaerobi, dok neke mogu rasti u prisustvu male koncentracije kiseonika. Vrste roda Clostridium su biohemijski aktivne i sintetišu veliki broj enzima koji im između ostalih daju saharolitičke i proteolitičke osobine. C. perfrigens se optimalno razmnožava na 37 oS do 44 oS.
Vrste roda Clostridium sintetišu jake egzotoksine koji se ponašaju kao antigeni i sadrže više antigenskih faktora. C. perfrigens sintetiše pet letalnih egzotoksina i jedan endotoksin, a takođe i više hemolizina i enzima koji se smatraju štetnim po čoveka jer imaju ulogu u širenju patoloških procesa.
C. perfrigens spada u sulforedukujuće bakterije, jer ima sposobnost redukcije natrijumsulfita (Na2SO3) do natrijumsulfida (Na2S). Na osnovu ove osobine se vrši njihova identifikacija, kroz sulfidni agar. Nastali natrijumsulfid sa solima gvožđa stvara gvožđesulfid (FeS) koji daje karakterističnu boju kolonijama klostridija.
Izolovanje i iedntifikacija sulforedukujućih klostridija se vrši pipetiranjem odgovarajućeg razređenja u epruvetu i ostavljanjem da odstoji 10 minuta na 80 oS. Nakon toga se sipa sulfidni agar i inkubira 3 do 5 dana na 37 oS. Ukoliko se primete crne loptaste kolonije, pristupa se potvrdnom testu koji se sastoji u bojenju po Gramu. Ukoliko su nalaz grampozitivne štapićaste bakterije sa ili bez spora, radi se o sulforedukujućim klostridijama.
.
Aerobne mezofilne sporogene bakterije tipa Bacillus subtilis – određivanje ukupnog broja u 1 ml mleka
Bacillus subtilis spada u familiju Bacillaceae. B. subtilis su štapićaste grampozitivne, katalazapozitivne, sporogene bakterije. Smatraju se striktnim aeorobima, međutim neka istraživanja pokazuju da mogu biti i fakultativni anaerobi. Obrazuju endospore, koje su veoma otporne na temperaturu, kiselost sredine i soli, što im omogućuje preživljavanje ekstremnih uslova spoljašnje sredine (Nakano and Zuber, 1998).
B. subtilis se ne ubraja u patogene za čoveka, međutim može izazvati neispravnost prehrambenih proizvoda i trovanje. Luči proteolitički enzim subtilisin.
U dve epruvete se otpipetira po 10 ml mleka, koje se zatim stave u vodeno kupatilo i drže na temperaturi od 97 oS u toku 2 minuta, nakon čega se uzorci brzo hlade prenošenjem na led. U sterilne Petri ploče se zaseje po 1 ml i sipa sterilan otopljen i na oko 45 oS ohlađen tripton agar. Inkubacija se vrši na 30 oS, a rezultati se očitavaju nakon 24 i 72 sata. Broje se kolonije i rezultati se množe faktorom razblaženja. Na taj način se dobija broj bakterija u 1 ml (posredno određivanje broja mikroorganizama).. Nalaz grampozitivnih sporogenih štapićastih bakterija dokazuje prisustvo B. subtilis.
.
Aerobne termofilne sporogene bakterije tipa Bacillus (Geobacillus) stearothermophilus – dokazivanje prisustva u mleku
Bacillus stearothermophilus spada u familiju Bacillaceae. B. stearothermophilus su štapićaste grampozitivne, sporogene bakterije. Termofilne su i rastu na raznim zemljištima i u termalnim izvorima.
U pet epruveta se otpipetira po 10 ml uzorka mleka, u drugih pet po 1 ml uzorka mleka i 9 ml obranog i sterilisanog mleka, a u trećih pet po 0,1 ml uzorka mleka i 9,9 ml obranog i sterilisanog mleka. Sve epruvete se stave u vodeno kupatilo na temperaturu od 97 oS -100 oS u toku 5 minuta, nakon čega se uzorci brzo hlade prenošenjem na led. Nakon hlađenja vrši se inkubacija na 50 oS do 55 oS u toku 72 sata. Zgrušavanje mleka ukazuje na prisustvo aerobnih termofilnih sporogenih bakterija tipa B. stearothermophilus.
Na osnovu broja epruveta sa pozitivnom reakcijom, pomoću Mac Gradye-ove tablice može se odrediti najverovatniji broj spora u 1 ml mleka.
Tabela 3: Mac Gradye-ove tablica
| Broj epruveta* | Broj bakterija | Broj epruveta | Broj bakterija | Broj epruveta | Broj bakterija |
| 000 | 0,0 | 200 | 0,9 | 300 | 2,5 |
| 001 | 0,3 | 201 | 1,4 | 302 | 6,5 |
| 010 | 0,3 | 202 | 2,0 | 310 | 4,5 |
| 011 | 0,6 | 210 | 1,5 | 311 | 7,5 |
| 020 | 0,6 | 211 | 2,0 | 312 | 11,5 |
| 100 | 0,4 | 212 | 3,0 | 313 | 16,5 |
| 101 | 0,7 | 220 | 2,0 | 320 | 9,5 |
| 102 | 1,1 | 221 | 3,0 | 321 | 15,0 |
| 110 | 0,7 | 222 | 3,5 | 322 | 20,0 |
| 111 | 1,1 | 223 | 4,4 | 323 | 30,0 |
| 120 | 1,1 | 230 | 3,0 | 330 | 25,0 |
| 121 | 1,5 | 231 | 3,5 | 331 | 45,0 |
| 130 | 1,6 | 232 | 4,0 | 332 | 110,0 |
*prvi broj predstavlja broj pozitivnih epruveta iz prvih 5 epruveta, drugi broj iz
drugih pet, a treći broj iz trećih pet epruveta.
.
Lipolitičke bakterije – izolovanje, identifikacija i određivanje ukupnog broja u 1 ml ili 1 g
Lipolitičke bakterije sintetišu enzime lipaze, koji vrše razgradnju mlečne masti uz oslobađanje masnih kiselina i glicerida. Oslobađanje nižih masnih kiselina ima za posledicu pojavu neprijatnog mirisa i ukusa što se naziva hidrolitička užeglost (Đorđević, 1982). Lipolitičke bakterije imaju sposobnost rasta pri relativno niskim temperaturama (5 oS) što otežava zaštitu proizvoda od njihovog delovanja.
Najznačajniji predstavnici lipolitičkih bakterija su vrste rodova Pseudomonas, Aeromonas, Flavobacterium, Micrococcus, Corynebacterium, Escherichia, Klebsiela i Bacillus.
U sterilne Petri ploče otpipetira se 1 ml odgovarajućeg razređenja i zalije sa oko 15 ml otopljenog i na 45 oS ohlađenog tributirin agara. Inkubacija se vrši na 30 oS u toku 72 sata. Ukoliko se pojave kolonije sa koncentričnom, svetlom, prozirnom zonom, veće od 1 mm, može se zaključiti da se radi o lipolitičkim bakterijama. Broje se kolonije i rezultati se množe faktorom razblaženja. Na taj način se dobija broj bakterija u 1 ml (posredno određivanje broja mikroorganizama).
.
Literatura
- Đorđević, J. (1982): Mleko. INI „PKB-Agroekonomik“. Beograd
- Koprivica, S. (2008): Metabolička aktivnost inokuluma kombuhe u proizvodnji funkcionalnog fermentisanog mlečnog proizvoda
- Nakano, M. M., Zuber, P. (1998): Aerobe growth of a “strict aerobe“ (Bacillus subtilis). Louisiana State University Medical Center Sheveport, Louisiana.
- Službeni list SRJ broj 26 (1993), 443 Pravilnik o mikrobiološkoj ispravnosti namirnica
- The microbiology of drinking water (2002) – Part 1 – Water Quality and Public Health, Department of the Enviroment
- Škrinjar, M. (2001): Mikrobiološka kontrola životnih namirnica. Tehnološki fakultet, Novi Sad.
- www.tehnologijahrane.com