QUANTITATIVE DETERMINATION OF MYCOTOXIN ZEARALENONE IN MILK AND CEREAL BASED BABY FOOD BY ELISA METHOD

Originalan naučni rad – Original scientific paper

Rezime

Osnovni cilj rada bio je da se ispita mogućnost kontaminacije uzoraka dehidrisane dječje hrane na bazi mlijeka navedenim mikotoksinom. Navedeni mikotoksin koji nastaje metaboličnom aktivnošću plijesni iz roda Fusarium i to najčešće F. culmorum, F. graminearum i F. crookwellense. Može biti prisutan u brašnu, krupici, korn fleksu itd. Najkarakterističniji toksični efekat zearalenona je da izaziva estrogene promjene. Smatra se da je zearalenon uzrokovao prijevremeni pubertet kod djece u Porto Riku.

Za utvrđivanje eventualnog prisustva zearalenona u dječjoj hrani korištena je ELISA metoda. Analize su rađene na Institutu za mljekarstvo Justus Liebig Univerziteta u Giessenu, Njemačka. Limit detekcije bio je 4 ng/g, a kvantitativno određivanje vršeno je spektrofotometrijski.

Italijansko ministarstvo zdravlja i britanska Agencija za standardizaciju hrane usvojili su standard o maksimalno dozvoljenim količinama zearalenona u dječjoj hrani od 20 ng/g. Od 24 ispitana uzorka dječje hrane, čak su četiri uzorka bila pozitivna na zearalenon, ali ni u jednom od uzoraka nije bila zabilježena koncentracija veća od standardom propisane.

Ključne riječi: mikotoksini, zearalenon, dječja hrana, estrogeni efekti

Summary

The main objective of this paper was to examine the possibility of zearelenone contamination of powdered milk based baby food samples.

Fusarium moulds (generally F graminearum, F. culmorum, F. crookwellense) produce mycotoxin zearalenone by their own metabolic activity. It is proved on experimental animals that zearalenone is toxic for reproductive system and because of that zearalenone is typical estrogenic mycotoxin. Correlation between zearalenone presence in food and human disease is not quite confirmed. However, it is believed that zearalenone caused early puberty in children in Porto Rico between 1978. and 1981. Children with noticed preterm sexual characteristics had a high level of zearalenone in blood.

Most of the baby food products are cereal based. They can contain maize, wheat, oat or barley kernel, flour, grits, or flakes and because of that there is a possibility that cereal based baby food may be contaminated with micotoxins like zearalenone.

ELISA method was used for quantitative determination of zearalenone content in 24 samples of milk based baby food. Analyses were carried out in the Institute for Dairy Science of Justus Liebig University in Giessen, Germany. Detection limit was 4 ng/g, and quantitative determination was performed by spectrophotometer with wave length 450 nm.

Four samples were positive on zearalenone, yet none of them contained zearalenone concentration higher than permitted limits. The highest level of 11,23 ng/g was found in one sample of baby food containing dried milk and whole wheat kernel.

Key words: zearalenone, baby food, estrogene efects

Uvod

U posljednjih nekoliko godina sve se veća pažnja poklanja izučavanju mikotoksina. Poznato je da mikotoksini uzrokuju čitav niz zdravstvenih problema kako kod životinja tako i kod ljudi. Mikotoksini nastaju kao produkti metabolizma različitih plijesni (uglavnom Aspergillus, Penicillium, Fusarium). Mogu se javljati na različitim proizvodima, a najčešće su kontaminirana žita i proizvodi od žita, te na taj način mogu dospjeti i u dječju hranu, ako ona u svom sastavu sadrži brašno, pahuljice ili neki drugi proizvod od žita. Zearalenon nastaje metabolizmom plijesni iz roda Fusarium, a najčešće vrste proizvođači zearalenona iz ovog roda su: F. graminearum1, F culmorum i F. crookwelense2. Ovaj mikotoksin karakterističan je za pšenicu, kukuruz, rižu i ječam, a može se naći u korn fleksu, pšeničnom hljebu, orasima, pivu i snek proizvodima (E M A N3, 2002). Zearalenon se rijetko nalazi u mlijeku (S u n d o l f i S t r i c k l a n d, 1986), ali ipak postoji mogućnost kontaminacije mlijeka rezidualnim zearalenonom. Zearalenon se izlučuje u mlijeko ako je prisutan u višim koncentracijama u stočnoj hrani kojom se hrane mliječne krave. Prema podacima W H O (2000) u kravljem mlijeku je zabilježena koncentracija zearalenona od 6,1 μg/kg. Istraživanja koja su proveli M i r o c h a i sar. (1981) u Minesoti (SAD) pokazala su da se zearalenon može naći u mlijeku u koncentraciji od 210 μg/l ako se krave sedam dana hrane stočnom hranom u koju se dodaje 25 μg/kg zearalenona svaki dan. Prema P r e l u s k y i sar. (1990) zearalenon nije pronađen u mlijeku krava koje su 21 dan preko stočne hrane unosile u organizam 50 i 165 mg zearalenona.

S obzirom na to da se zearalenon može naći kako u žitu i proizvodima od žita tako i u mlijeku, razumljivo je da dječja hrana može biti kontaminirana ovim mikotoksinom.

Pod dječjom hranom podrazumijeva se veoma široka i po sastavu složena grupa proizvoda. To su uglavnom proizvodi koji se proizvode od kravljeg mlijeka i predstavljaju zamjenu ili dopunu za majčino mlijeko.

Strukturna formula zearalenona

Slika 1. Chemical structure of zearalenone

Hemijske karaktreistike. Zearalenon (ZEA) je bijela kristalna supstanca koja pod uticajem dužih UV talasa (360 nm) daje plavo-zelenu fluorescenciju. Rastvoren u etanolu UV zrake najbolje apsorbuje pri talasnoj dužini od 314 nm, a najbolju emisiju ima pri 450 nm. Ova osobina zearalenona se koristi za njegovo kvantitativno određivanje. Slabo se rastvara u vodi (0,002 g/100ml). Djelimično je topiv u heksanu, a mnogo bolje u benzenu, acetonitrilu, metanolu, etanolu i acetonu (E M A N, 2002). Tačka topljenja zearalenona je između 164-165 oC (Roth-Frank-Korman, 1990). Na slici 1. prikazana je strukturna formula zearalenona (S h i e r, 1998).

Zearalenoni su monociklični laktoni molekulske mase 318. Empirijska formula je C18H22O5. Laktonski prsten je otporan na kiselinsku hidrolizu, ali se može dekarboksilirati. Redukcijom sa natrijum boroksidom nastaju alfa i beta zearalenon (Shier, 1998). Postoji više aktivnih supstanci koje se mogu smatrati zearalenonima. Smatra se da je iz kukuruza moguće izdvojiti čak sedam zearalenona, a iz ovčjeg i kravljeg mlijeka izolovana su dva zearalenona (EMAN, 2001; S h i e r, 1998).
Naziv zearalenon (ZEARALENONE) je izvedenica dobivena od sljedećih pojmova:

ZEA-Gibberela zeae,
RAL-resorcyclic acid lacton,
ENE-sufiks za jedinjenja sa dvostrukom vezom između dva C atoma i
ONE-sufiks za ketone (keto grupa je na šestom C atomu).

Toksični efekti zearalenona i regulativa

Zearalenon (ZEA) spada u estrogene mikotoksine i njegov najznačajniji toksični efekat je djelovanje na reproduktivni sistem. Povezanost između prisustva zearalenona i bolesti kod ljudi još uvijek nije potpuno dokazana. Smatra se da je zearalenon u periodu između 1978. i 1981. godine uzrokovao prijevremeni pubertet kod djece u Porto Riku. Zearalenon je pronađen u krvi djece kod koje su primijećene prijevremene spolne karakteristike, a najvjerovatnije je u organizam dospio konzumiranjem kontaminiranog kukuruza. Ne postoji dovoljno dokaza da se zearalenonu pripišu kancerogena svojstva (S h i e r, 1998), a što se tiče genotoksičnosti jači dokazi postoje samo za miševe (E M A N, 2001).

Regulativa. Sa ciljem da se utvrde granične količine zearalenona iznad kojih može doći do hormonskih promjena kod ljudi JECFA1 je provela istraživanje 2000. godine i predloženo je da se usvoje gornje granice od 0,2 μg zeralenona po kilogramu tjelesne mase. Italijansko Ministarstvo Zdravstva 1999. godine predlaže da se usvoje MDK2 zearalenona u dječjoj hrani, a koje iznose 20 ng/g (E M A N, 2001, F A O, 2003). Ista gornja MDK od 20 ng/g za zearalenon u dječjoj hrani propisana je i od strane britanske Agencije za standardizaciju hrane SFA (Reference ENF/E/07/040, 2007). Standardima propisane gornje granice zeralenona u dječjoj hrani postoje u još nekim zemljama. Tko npr. u Ukrajini MDK zearalenona u dječjoj hrani je 40 ng/g, dok u Bjelorusiji standardima je propisano da uzorci dječje hrane ne smiju nikako sadržavati zearalenon (F A O, 2003).

Prema Evropskom standardu MDK ZEA-a u prehrambenim proizvodima iznosi 0,05 mg/kg ili 50 ng/g (E C D i r e c t i v e 466, 2001). U Bosni i Hercegovini ne postoje standardi u kojima su definisane maksimalno dozvoljene količine zearalenona.

Materijal i metode rada

Ispitivanja su vršena na 24 uzorka dječje hrane različitih proizvođača sa njemačkog tržišta. Svi uzorci su bili u dehidrisanom obliku i kao osnovni sastojak sadržavali su mlijeko, a deklarisani su kao dehidrisane mliječne kaše sa žitaricama ili voćem.

Analize su rađene na Institutu za Mljekarstvo Justus Libig Univerziteta u Giessenu, Njemačka. Za utvrđivanje sadržaja zearalenona u dječjoj hrani korištena je ELISA3 metoda. Prvi korak u okviru ovog istraživanja je bio razvoj metode tj. utvrđivanje laboratorijske procedure za određivanje zearalenona ELISA metodom. Važno je napomenuti da se korištena metodologija, koja je opisana u ovom radu, ne navodi nigdje drugo u literaturi i da je cjelokupna procedura od pripreme uzoraka, ekstrakcije mikotoksina i njegovog kvantitativnog određivanja u potpunosti razvijena na Institutu za mljekarstvo Justus Liebig Univerziteta.

Raspored udubljenja mikrotitr posudice sa standardima i uzorcima prilikom određivanja zearalenona u uzorcima dječje hrane

Slika 2. Scheme of microtiter wells with standards and baby food samples for quantitative determination of zearalenone

Ekstrakcija zearalenona iz uzorka dječje hrane rađena je primjenom 70% metanola. Udubljenja mikrotiter posudice prije doziranja uzorka tretirana su antiserumom rastvorenim u bikarbonatnom puferu u omjeru 1:4000. Ovaj antiserum izolovan je iz krvi zečeva na Justus Liebig Univerzitetu. Kao enzimski konjugat za vezivanje sa antiserumom korišten je ZEA OXIM HRP1 rastvoren u 1% rastvoru kazeina u PBS2 puferu.. Inkubacija je trajala dva sata na sobnoj temperaturi uz stalno lagano miješanje. Kvantitativno određivanje zearalenona vršeno je spektrofotometrijskom metodom. Kao indikator za promjenu boje služio je rastvor tetrametilbenzidina (TMB) u vodonik preoksidnom puferu koji sa konjugatom daje plavu boju. Reakcija sa indikatorom je trajala 10-15 minuta i zaustavljala se doziranjem 1M H2SO4, pri čemu je plava boja prelazila u žutu. Mjerenje intenziteta žute boje vršeno je na spektrofotometru pri talasnoj dužini od 450 nm. Kao standardi su korištene različite koncentracije zearalenona u metanolu, a svaki treći uzorak radi kontrole bio je tretiran sa zearalenonom u koncentraciji od 40 ng/g. Na slici 2. dat je shematski prikaz mikrotiter posudice sa standardima i uzorcima.

Rezultati i diskusija

Od 24 analizirana uzorka dječje hrane sa njemačkog tržišta, četiri uzorka se smatraju pozitivnim jer su sadržavali zearalenon u koncentraciji iznad limita detekcije od 4 ng/g. Mliječna kaša sa cijelim pšeničnim zrnom je sadržavala najviši nivo kontaminacije koji je iznosio 11,23 ng/g. U preostala tri uzorka nivoi kontaminacije zearalenonom bili su znatno niži i iznosili su 4,95 ng/g u mliječnoj kaši sa cijelim pšeničnim zrnom, 4,71ng/g u mliječnoj kaši sa cijelim pšeničnim zrnom i malinama i 4,56 ng/g u mliječnoj kaši sa pšeničnim grizom i bananama. Nijedan od ispitanih uzoraka dječje hrane nije sadržavao više od 20 ng/g zearalenona (MDK predviđena italijanskim i britanskim standardima). Tri od četiri pozitivna uzorka sadržavali su u svom sastavu cijelo pšenično zrno, što potvrđuje da je mogućnost kontaminacije žita plijesnima, pa samim tim i mikotoksinima veća na površinskim u odnosu na unutrašnje dijelove zrna žita. Rezultati istraživanja prikazani su u tabeli 1.

Tabela 1. Zearalenone content in four positive samples

Na slici 3. prikazan je izgled mikrotitr posudice sa analiziranim standardima i uzorcima dječje hrane prilikom određivanja zearalenona ELISA metodom. Tamnija polja označavaju nižu koncentraciju zearalenona. Uzorak u kojem dominiraju svjetlija polja (donji srednji dio mikrotitr posudice) je kontrolni uzorak sa zearalenonom u koncentraciji od 40 ng/g.

Izgled mikrotitr posudice prilikom određivanja zearalenona u dječjoj hrani prije zaustavljanja reakcije sa rastvorom H2SO4

Slika 3. Microtiter container with samples and standards during determination of zearalenone in baby food samples just before stoping reaction with H2SO4

Slične rezultate o kontaminaciji dječje hrane zearalenonom navode i drugi autori.

Prema podacima britanske Agencije za standarde (Standard Food Agency, 2003) od 17 analiziranih uzoraka dječje hrane na bazi mlijeka i žita, jedan je uzorak bio pozitivan na zearalenon (dehidrisana kaša sa bananom). Primjenom imunoafinitivne HPLC metode i pri kvantifikacijskom limitu od 8 ng/g sadržaj zearalenona u ovom uzorku iznosio je 11,6 ng/g.

R o s c o e i sar. (1998) navode da je od 60 uzoraka dječje hrane namijenjene dojenčadi u Kanadi, devet uzoraka bilo pozitivno na mikotoksin zearalenon a prosječan nivo kontaminacije iznosio je 4,2 ng/g. Istraživanja su provedena i u Japanu 1986. godine na 27 uzoraka dječje hrane i niti u jednom uzorku nije pronađen zearalenon (I s o h a t a i sar., 1986).

Zaključak

Karakterističan toksični efekat zearalenona je da izaziva estrogene promjene. Smatra se da je zearalenon uzrokovao prijevremeni pubertet kod djece u Porto Riku. Ovaj mikotoksin je pronađen u krvi djece kod koje su primijećene prijevremene spolne karakteristike, a najvjerovatnije je u organizam dospio konzumiranjem kontaminiranog kukuruza.

Ispitivanja su vršena na 24 uzorka dječje hrane na bazi mlijeka i žita različitih proizvođača. Kvantitativno određivanje zearalenona rađeno je ELISA metodom. Od 24 analizirana uzorka, čak četiri su bila pozitivna jer su sadržavali zearalenon u koncentraciji iznad limita detekcije (4ng/g). Tri od četiri pozitivna uzorka sadržavali su u svom sastavu cijelo pšenično zrno, što je u skladu sa činjenicom da je mogućnost kontaminacije žita plijesnima, a samim tim i mikotoksinima veća na površinskim u odnosu na unutrašnje dijelove zrna. Nijedan uzorak nije sadržavao zearalenon u koncentraciji većoj od koncentracije predviđene italijanskim i britanskim standardima (20 ng/g). Proizvođači dječje hrane trebali bi provoditi rigorozniju kontrolu sirovina na mikotoksine, s obzirom da su svi mikotoksini izrazito toksične materije i mogu izazvati čitav niz nepovratnih zdravstvenih problema i problema u rastu i razvoju beba pa i male djece. Time bi se smanjila mogućnost prisustva mikotoksina u koncentracijama iznad dozvoljenih.

Literatura

EC Directive 466, (2001)., Comission Regulation (EC).
EMAN (European Mycotoxins Awareness Network), (2002)., Fact sheets: Zearalenone and Deoxinivalenol, Leatherhead Food International, England.
FAO (Food Agriculture Organisation), (2003), Worldwide regulations for mycotoxins in food and feed in 2003. , Agriculture and Consumer Protection, FAO Coorporate Document Repository.
Gilbert J., (1989)., Current views on the occurence and significance of fusarium toxins, J. Appl. Bacteriol. Symp. Suppl.
Isohata E., Toyoda M., Saito Y., (1986), Studies on the chemical analisis of mycotoxin (XIV). Analytical results on zearalenone in baby foods., Eisei Shikenio Hokoku 104.
Mirocha C.J., Pathre S.V., Robinson T.S., (1981) Comparative metabolism of zearalenone and transmission into bovine milk. Food Cosmet. Toxicol. 19.
ROTH-FRANK-KORMAN, (1990)., Giftpilze-pilzgifte, Schimmenpilze-mycotoxine, Nahrungsmitelvergriftungen, Nikol Vertagsgessellschaft mbH Co. KG Hamburg.
Prelusky D.B., Scott P.M., Trenholm H., Lawrence G.A., (1990), Minimal transmission of zearalenone to milk of diary cows, J. Environ. Sci. Health B 25.
REFERENCE: ENF/E/07/040, (2007), Application of Maximum Levels for the Fusarium Toxins Deoxynivalenol and Zearalenone in Maize and Maize-Based Products as Laid Down in Commission Regulation (EC) NO. 1881/2006, Revised maximum levels for deoxynivalenol and zearalenone, Food Standard Agency.
Roscoe V.A., (1998)., Determination of Zearalenone in Infant Foods using Immunoaffinity Columns and High Performance Liquid Chromatography (WGP-LB-25) Ottawa, Health Protection Branch Central Region.
Shier W. T., (1998)., Estrogenic mycotoxins, Revue Med. Vet. 149.
Standard Food Agency, (2003), Survey Of Retail Cereal Products for Trichothecenes and Zearalenone, Library and Information Service, London WC2B 6NH.
Sundolf S.F., Strickland C., (1986) Zearalenone and zeranol: Potential residue problems in livestock, Vet. Hum. Toxicol. 28.
WHO, (2000), Safety evaluation of certain food additives and contaminants: Zearalenone, International programme on chemical safety (IPCS), Who Additives series 44, 43rd Meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, Geneve, 2000.