Autor: dipl. biolog – master Vladimir Vukić
E-mail: vladimirvukic@gmail.com
.

.
PCR tehnologija je uspešno primenjena u detekciji sastojaka životinjskog porekla u mesnim, mlečnim i ribljim proizvodima. PCR je veoma bitan i kod ispitivanja hrane biljnog porekla, naročito za detekciju genetički modifikovanih organizama (GMO).
.

Mesni proizvodi

Najčešća zloupotreba u proizvodnji mesnih proizvoda je dodavanje svinjskog mesa goveđem radi ekonomske dobiti. To može imati zdravstvene posledice po potrošače. Ukoliko je osoba alergična na svinjsko meso, može imati ozbiljne zdravstvene probleme. Takođe, osobe muslimanske veroispovesti iz verskih razloga ne konzumiraju svinjsko meso. Prisustvo svinjske DNK je otkriveno upotrebom prajmera za gen koji determiniše svinjski hormon rasta, omogućavajući detekciju prisustva svinjskog mesa sa pragom detekcije ispod 2 % masenog udela. Korišćenjem prajmera za citohrom b mitohondrijalne DNK i upotrebom restrikcionih enzima (PCR-RFLP) dobijeni su markeri za svinjsko, goveđe, bivolsko, ovčije, kozije, konjsko, kokošije i ćureće meso u obrađenim, začinjenim i fermentisanim proizvodima (Meyer i sar. 1995). Prag detekcije je ispod 1 % masenog udela. Detekcija svinjskog mesa je takođe uspešna i umnožavanjem D-loop i 12S rRNK mitohondrijanle DNK u mlevenom mesu, uključujući sušene i termički obrađene proizvode (Montiel-Sosa i sar. 2000) (Tab. 4).

Upotrebom repetitivnih elemenata SINE i primenom semikvantitativne PCR tehnike svinjsko meso se može detektovati sa pragom detekcije od oko 0,005 % masenog udela. Real-time PCR eseji specifični za vrstu su uspešno korišćeni za detekciju goveđeg, svinjskog, jagnjećeg, kokošijeg i ćurećeg mesa, sa pragom detekcije od 0,1 % masenog udela. Kvantitativno određivanje svinjskog mesa u mlevenom mesu je postignuto upotrebom QC-PCR-a i real-time PCR-a sa TaqMan probama (Wolf i Lüthy 2001).

Meso divljači je zbog skupocenosti na tržištu često meta lažnog obeležavanja. Usled toga je razvijena PCR-RFLP tehnika koja koristeći dve endonukleaze može da otkrije 25 vrsta divljači (Wolf i Rentsch 1999). Mutsunaga i sar. (1999) su razvili brzu i jednostavnu metodu za otkrivanje mesa poreklom od šest vrsta (goveče, svinja, ovca, kokoška, koza i konj) upotrebom multipleks PCR-a i mitohondrijskog gena za citohrom b kao marker.

Tabela 4: Metode za proveru ispravnosti mesnih proizvoda zasnovane na PCR-u

Prehrambeni proizvod	Vrsta	Tehnika	Marker gen	Prag detekcije
goveđe meso	svinja	PCR-RFLP	cytohrom b	<1%
		PCR-RFLP	D-loop	5%
		PCR-RFLP	cytohrom b	nema podataka
		PCR specifična za vrstu	12 S rRNK	nema podataka
		PCR specifična za vrstu	SINE	0.05 %
		QC-PCR/PCR-RFLP	hormon rasta	0,1%, 100 pg
		real-time PCR	12 S rRNK	0,1%, 100 ng
divljač	25 vrsta divljači	PCR-RFLP	cytohrom b	nema podataka
	crveni jelen, jelen lopatar, srna, goveče, ovca, koza	PCR-RFLP	12 S rRNK	nema podataka
kuvani mesni proizvodi	goveče, svinja, kokoška, ovca koza, konj	multipleks PCR	cytohrom b	0,25 ng DNK
	goveče, svinja, jagnje, kokoška i ćurka	real-time PCR	cytohrom b	0.1-0,5 %

.

Morski plodovi

Potrošnja morske hrane u svetu raste sa promenom ljudske svesti o povezanosti ishrane i zdravlja. Sličnosti između vrsta otežavaju identifikaciju vrsta. Šta više, većina vrsta se prodaje bez karakterističnih morfoloških karaktera što praktično onemogućuje njihovu identifikaciju.

Metode zasnovane na PCR-u (Tab. 5) koje se primenjuju pri identifikaciji ribljih vrsta uključuju: PCR-RFLP (Asensio i sar. 2000; Asensio i sar. 2001), PCR-SSCP (Asensio i sar. 2001), RAPD (Asensio i sar. 2002) prajmeri PCR-a specifični za vrstu (Céspedes i sar. 1999) i sekvencioniranje umnoženih delova DNK (Asensio i sar. 2000).

Najčešće korišćeni marker za identifikaciju ribljih vrsta je gen za citohrom b. Upotrebom gena za citohrom b može se identifikovati deset različitih vrsta pastrmki. Veoma česta prevara na tržištu ribe je prodavanje niskog grgeča (Lates niloticus) umesto skupocenih vrsta Epinephelus guaza ili Polyprion americanus. Usled toga je razvijeno nekoliko tehnika pomoću kojih se ove vrste mogu razlikovati. PCR umnožavanje gena za α aktin u kombinaciji sa dve restriktivne endonukleazeomogućuje razlikovanje nilskog grgeča od Polyprion americanus (Asensio i sar. 2001). Razlike između tri vrste su takođe postignute upotrebom PCR-RFLP (Asensio i sar. 2000), PCR-SSCP (Asensio i sar. 2001) i RAPD (Asensio i sar. 2002) metoda.

Tuna je najprodavanija riba u svetu. Tuna obuhvata rodove Thunus, Sarda, Katsuvonus i Euthynnus. Različite vrste imaju različitu tržišnu cenu u zavisnosti od zemlje u kojoj se prodaju. Uklanjanje morfoloških karakteristika filetiranjem ili drugim procesima, i termička obrada (denaturacija proteina) kojoj podležu svi konzervirani proizvodi, ostavljaju melekularne markere kao jedinu mogućnost identifikacije. Temperaturni tretman degradira DNK molekule na 100 – 200 baznih parova. Analiza gena za citohrom b sekvencionoranjem ili RFLP metodom omogućuje razlikovanje Thunnus albacares, T. alabunga i Euthinus affinis u konzerviranom stanju.

Tabela 5: Metode za proveru ispravnosti ribljih proizvoda zasnovane na PCR-u

Prehrambeni proizvod	Vrsta	Tehnika	Marker gen
Sirovo i prženo	List riba	PCR specifična a vrstu	5 S rRNK
	Sarranidae	PCR-RFLP	12 S rRNK
		RAPD
		PCR-RFLP	α-aktin
		PCR-SSCP	12 S rRNK
Sirovo, dimljeno i konzervirano	jegulja i skuša	PCR-RFLP/ PCR-SSCP	cytohrom b
sirovo, smrznuto, usoljeno, termički obrađeno	Gadidae	PCR-RFLP	cytohrom b
		PCR sekvencioniranje /RFLP	Mitohondrijalni kontrolni region

.

Mlečni proizvodi

Kontrola sadržaja mlečnih proizvoda je veoma važna zbog učestalih nečistoća koje podrazumevaju dodavanje manje kvalitetnog i jeftinijeg mleka visokokvalitetnom i skupljem. Identifikacija porekla mleka je naročito važna pri proizvodnji sireva od čistih, retkih i skupih rasa stoke (Tab. 6).

Razvijeno je nekoliko PCR metoda koje omogućavaju identifikaciju porekla mleka (kravlje, kozije, ovčije, bivolsko) (Bania i sar. 2001). Identifikacija se može vršiti i kod termički obrađenih proizvoda kao što su pasterizovano, ultrapasterizovano ili mleko u prahu, kao i kod sireva. Najjednostavniji metod je PCR umnožavanje gena za β-kazein (Plath i sar. 1997). Međutim, trenutna saznanja ukazuju da mitohondijska DNK može biti pogodnija za ispitivanja ovog tipa. Mitohondijska DNK poseduje sekvence karakteristične za vrstu, što je čini veoma pogodnom za njihovu identifikaciju. Takođe, broj prisutnih kopija je oko hiljadu puta viši od broja kopija nuklearne DNK, što omogućuje njihovu lakšu detekciju. Kombinovanje PCR-a sa drugim metodama kao što su PCR-RFLP ili PCR-SSCP omogućuje detekciju kravljeg mleka u ovčijim i kozijim sirevima sa pragom detekcije od 0,5 % masenog udela. Međutim, mitohondrijski geni su se pokazali pogodnijim i preciznijim za detekciju nečistoća u mleku, snižavajući prag na 0,1 % masenog udela.Upotreba mitohondrijskih gena za 12S rRNK omogućuje otkrivanje prisustva kravljeg mleka u mešavini ovčijeg i kozijeg (Maudet i Taberlet 2001).

Jedan od najpoznatjih italijanskih sireva mocarela, pravi se od čistog bivolskog mleka (Bubalus bubalis). S obzirom na visoku cenu bivolskog mleka, proizvođači često dodaju kravlje, i na taj način stiču ekonomsku dobit na račun svojih potrošača. Razvijeno je nekoliko PCR tehnika za otkrivanje ovakvih zloupotreba. Umnožavanje gena za citohrom b omogućuje otkrivanje kravljeg mleka u mocareli sa pragom detekcije od 0,1 % masenog udela (Lopez-Caljeja i sar. 2005). Otkriveno je da u 22 od 30 uzoraka ima prisustva kravljeg mleka. Upotrebom real-time PCR tehnike potrvđeno je da većina mocarela sireva sadrže primese kravljeg mleka (Lopparelli i sar. 2007).

Upotrebom gena za mitohondrijske 12S rRNK može se detektovati prisustvo kozijeg mleka u ovčijem siru, sa pragom detekcije od 1 % masenog udela. Ovo je takođe česta prevara zbog niže cene kozijeg mleka (Lopez–Cellaja i sar. 2005). Upotrebom dvostrukih PCR reakcija prag detekcije je snižen na 0,1 % masenog udela. Korišćenjem fluorescentnih boja i upoređivanjem intenziteta fluorescencije određivan je udeo kravljeg mleka u takvim sirevima (Marfa i sar. 2004). Takođe je razvijena i real-time PCR za određivanje udela kravljeg mleka (Lopez–Cellaja i sar. 2007).

Kao marker za određivanje porekla mleka može se koristiti i gen za citohrom b. Komparativnom analizom 92 segmenta gena za citohrom b, dizajnirani su prajmeri specifični za željenu (krava, koza, ovca i bivo) vrstu.

Tabela 6: Metode za proveru ispravnosti mlečnih proizvoda zasnovane na PCR-u

Prehrambeni proizvod	Vrsta	Tehnika	Marker gen	Prag detekcije %
Mleko, čisti i mešani sirevi	krava, ovca, koza, bivo	PCR-RFLP	β-kazein	0,5
Mocarela sirevi	krava, bivo	dupleks PCR	cytohrom b	1
	5	PCR specifična za vrstu	12 S rRNK	0,1
	6	real-time PCR	cytohrom b / hormon rasta	0,1
Koziji i mešani sirevi	krava	PCR specifična za vrstu	D-loop	0,1
krava, koza	dupleks PCR	12 S rRNK	0,1
Ovčiji i mešani sirevi	koza, ovca	PCR specifična za vrstu	12 S rRNK	1
Sirovo i termički obrađeno mleko	krava, ovca	PCR specifična za vrstu	12 S rRNK	0,1
	koza, ovca	real-time PCR	12 S rRNK	0,5
	krava, ovca	real-time PCR	12 S rRNK	0,5
Kamember i feta sirevi	krava	PCR specifična za vrstu	citohrom oksidaza II /D-loop/ cytohrom b/12 S RNK	0,5

.

Biljna hrana

Metode zasnovane na PCR-u imaju važnu ulogu u identifikaciji hrane biljnog porekla, na primer kod: žitarica, leguminoza ili za detekciju različitih alergena (Tab.7). Verovatno najveću primenu imaju u identifikaciji genetički modifikovanih organizama (GMO), uglavnom kod soje i kukuruza.

Pri proizvodnji maslinovog ulja usled termičke obrade i rafinisanja dolazi do delimične degradacije DNK molekula. Međutim, postignuti su zadovoljavajući rezultati, i izolovana je adekvatna količina DNK koja može poslužiti za identifikaciju sorte masline korišćene za proizvodnju ulja. Primenom AFLP metode na takvoj DNK dobijeni su identični rezultati kao i na DNK izolovanoj iz maslina date sorte, što potvrđuje uspešnost metode (Busconi i sar. 2003). Sirovina za cedjenje ulja je perikarp masline poreklom od materinskog tkiva, te se za identifikaciju genotipa sagledava molekularni profil genotipa majke. Pri ovim ispitivanjima treba biti veoma oprezan, jer je utvrđeno da postoji mogućnost da se tokom procesa cedjenja ulja, usled loma semena, u uzorku pojavi i „strana“ DNK poreklom od embriona (koja predstavlja deo genotipske kombinacije poreklom od donora polena).

Žitarice kao što su pšenica, ječam ili raž, sadrže rezervne proteine koji se nazivaju gluten. Osobe sa netolerancijom na gluten (celijačna bolest) nisu u mogućnosti da konzumiraju proizvode sa njegovim sadržajem. Kod takvih osoba u tankom crevu dolazi do imunološko tokšične reakcije koja oštećuje mukozu creva. Ishrana bez glutena je esencijalna za ovakve osobe, usled čega je neophodno ispravno obeležiti prehrambene proizvode. Po pravilniku Codex Aimentarius Commission hrana bez glutena se pravi od delova koji ne sadrže gluten više od 0,002 % masenog udela, ili 0,02 % masenog udela suve materije. Metode koje se koriste za detekciju glutena su uglavnom imunoesejske analize (na primer ELISA). Međutim, upotreba PCR tehnike omogućuje detekciju kontaminacije sa pragom od 0,01 % masenog udela, što je oko deset puta osetljivije od ELISA testa (Köppel i sar. 1998).

Tradicionalna italijanska pasta se proizvodi od čiste durum (tvrde) pšenice (Triticum durum ili Triticum turgidum subsp. durum). Međutim, za njeno pravljenje često se upotrebljava meka pšenica (Triticum aestivum). Upotrebom dvostrukog PCR-a je moguće detektovati obe vrste pšenice sa pragom detekcije od 0,2 % masenog udela (Arlorio i sar. 2003). Uspeh je takođe postignut upotrebom mikrosatelita sa pragom detekcije od 3-5 %. Upotrebom real-time PCR-a prag je snižen na 2,5 % i omogućena je kvantifikacija meke pšenice (Pasqualone i sar. 2007). Razlikovanje ekonomski važnih vrsta žitarica postignuto je umnožavanjem specifičnim prajmerima hloroplastne trnL intronske sekvence i detektovanjem obeleženim probama (Ronning i sar. 2005).

PCR tehnka je našla svoju primenu i u detektovanju prisustva alergena u hrani. Njihovo prisustvo u hrani je neophodno kontrolisati, jer oni mogu izazvati ozbiljne posledice osobi koja je na njih osetljiva. Lešnik se može detektovati prostom upotrebom PCR-a sa specifičnim prajmerima za lešnik sa pragom detekcije od 0,001 % masenog udela (Holzhauser i sar. 2000). Takođe se može kombinovati sa probama ili visokopritisnom tečnom hromatografijom (HPLC). Kao probe se koriste PNK probe (protein nukleinska kiselina) koje se od DNK razlikuju u tome što umesto šećer-fosfatnog kostura imaju pseudopeptidni lanac sastavljen od N-aminoetilglicin monomera. Na ovaj način je moguće detektovati količinu DNK lešnika od svega 5 pg.

Kikiriki predstavlja jedan od najproblematičnijih alergena zbog velikog broja alergičnih osoba i jačine reakcije koja se kod njih javlja. PCR esej sa upotrebom TaqMan proba omogućuje specifičnu detekciju sa pragom do 0.0001 % masenog udela. Istraživanja su pokazala da u 13 % neobeleženih proizvoda ima prisustva kikirikija, kojim se uglavnom zamenjuje lešnik (Stephan i Veiths 2004). Upotrebom PCR-a i real-time PCR-a je takođe uspešno detektovano prisustvo oraha u hrani sa pragom detekcije od 0,24 ng DNK i 0,01 % masenog udela (Brezna i sar. 2006).

Tabela 7: Metode za proveru ispravnosti biljnih proizvoda zasnovane na PCR-u

Prehrambeni proizvod	Vrsta	Tehnika	Marker gen	Prag detekcije
Maslinovo ulje	sorte Olea europea	SSR	mikrosateliti	nema podataka
		AFLP/RAPD		nema podataka
Gluten u hrani	pšenica	PCR specifična za vrstu	nema podataka	0,1 %
Hleb, pasta	meka i tvrda pšenica	Dupleks PCR	puroindoline b	0,2 %
		SSR/PCR specifična za vrst/real-time PCR	mikrosateliti	2,5 %
Žitarice	pšenica, raž, ječam, ovas,pirinač, kukuruz	PCR oligonukleotidni mikroerey	hlohoplastni trnL intron	20-40 ng DNK
Alergeni u hrani	lešnik	PCR specifična za vrstu	Cor a 1,0401	0,001 %
		PCR/PNK-HPLC	Cor a 1,0301	5 pg DNK
	kikiriki	real-time PCR	Ara h 2	<0,001%
	orah	real-time PCR	Jug r2	0,24ng DNK /0,01 %

.

Genetički modifikovani organizmi (GMO)

Od samog početka proizvodnje vodi se naučna debata o bezbednosti upotrebe i neophodnosti obeležavanja genetički midifikovanih organizama u ljudskoj ishrani. Evropska unija je donela zakon po kome je neophodno obeležiti prehrambene proizvode koji sadrže više od 0,9 % masenog udela poreklom od GMO (Regulation (EC) No 1829/2003).

Detekcija GMO se vrši upotrebom specifičnih PCR reakcija (prajmera) koji mogu identifikovati različite delove unešenog genskog konstrukta. Ciljni region može biti promotor, terminacioni signal, sam funkcionalni gen ili mesta vezivanja gena za domaćinsku DNK koja daju najveću preciznost u otkrivanju GMO (Holst-Jensen i sar.2003). Kao i uvek PCR je praćen elektroforetskim razdvajanjem, u ovom slučaju na agaroznom gelu. Identitet fragmenata se može potvrditi i korišćenjem restrikcionih enzima.

Primenom višestrukih PCR reakcija koje se baziraju na istovremenom umnožavanju različitih sekvenci, čime se štedi vreme i smanjuje broj reakcija potrebnih za detekciju prisustva GMO. Na taj način su proizvedeni markeri za otkrivanje genetički modifikovanih sorti kukuruza Bt11, MON810, T25 i GA21 sa preciznošcu od 100 % (Hernandez i sar. 2005). Razvijena je višestruka DNK mikroerej čip tehnika u kombinaciji sa kolorimetrijskom detekcijom koja omogućuje identifikovanje GMO (Leimanis i sar. 2006). Za kvantitativno određivanje GMO trenutno je najpogodniji real-time PCR, a može se upotrebiti i QC-PCR.
.

Literatura

1. Anon. (1999): Microbiology of food and feeding stuffs— Protocol for the validation of alternative methods. Document established by the Joint Group of MicroVal (WG 6) and CEN (WG 6/TAG 2). ISO/DIS 16140, Geneva, Switzerland.
2. Anon. (1999A): Microbiology of food and animal feeding stuff—carcass sampling for microbiological analysis. ISO/CD 17604. International Organization for Standardization, Geneva, Switzerland.
3. Anon. (2000): Microbiology of food and animal feeding stuff—Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilution for microbiological examination. Doc CEN/TC 275/ WG 6 N 114. Published by AFNORE, Paris, France.
4. Anon. (2001): Protocol for the validation of alternative microbiological methods. NV-DOC.D-2001-04-25. Published by NordVal. Copenhagen, Denmark.
5. Arlorio, M., Coïsson, J. D., Cereti, E., Travaglia, F., Capasso, M., Martelli, A. (2003): Eur Food Res Technol 216: 253–258.
6. Asensio, L., González, I., Fernández, A., Céspedes, A., Hernández, P. E., García, T., Martín, R. (2000): J Food Prot 63: 1248–1252.
7. Asensio, L., González, I., Fernández, A., Rodríguez, M. A., Hernández, P. E., García, T., Martín, R. (2001): J Agric Food Chem 49: 1720–1723.
8. Asensio, L., González, I., Fernández, A., Rodríguez, M. A., Lobo, E., Hernández, P. E., García, T., Martín, R. (2001): Arch Lebensmittelhyg 52: 131–134.
9. Asensio, L., González, I., Fernández, A., Rodríguez, M. A., Lobo, E., Hernández, P. E., García, T., Martín, R. (2002): J Food Prot 65: 432–435.
10. Bania J, Ugorski M, Polanowski A, Adamczyk E (2001) J Dairy Res 68:333–336
11. Borst, A., Box, A. T., Fluit A. C. (2004): False-positive results and contamination in nucleic-acid amplification assays: Suggestions for a “prevent and destroy“ strategy. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 23: 289-299.
12. Brezná, B., Hudecová, L., Kuchta, T. (2006): Eur Food Res Technol 223: 373–377.
13. Busconi, M., Foroni, C., Corradi, M., Bongiorni, C., Cattapan, F., Fogher, C. (2003): Food Chem 83: 127–134.
14. Céspedes, A., García, T., Carrera, E., González, I., Hernández, P. E., Martín, R. (1999): J Agric Food Chem 47: 1046–1050.
15. Doveri, S., O’Sullivan, D. M., Lee, D. (2006): J Agric Food Chem 54: 9221–9226.
16. Hernández, M., Rodríguez-Lazaro, D., Zhang, D., Esteve, T., Pla, M., Prat, S. (2005): J Agric Food Chem 53: 3333–3337.
17. Holst-Jensen, A., Rønning, S. B., Løvseth, A., Berdal, K. G. (2003): Anal Bioanal Chem 375: 985–993.
18. Holzhauser, T., Wangorsch, A., Vieths, S. (2000): Eur Food Res Technol 211: 360–365.
19. Köppel, E., Stadler, M., Lüthy, J., Hübner, P. (1998): Z Lebensm Unters Forsch A 206: 399–403.
20. Leimanis, S., Hernández, M., Fernández, S., Boyer, F., Burns, M., Bruderer, S., Glouden, T., Harris, N., Kaeppeli, O., Philipp, P., Pla, M., Puigdomènech, P., Vaitilingom, M., Bertheau, Y., Remacle, J. (2006): Plant Mol Biol 61: 123–139.
21. López-Calleja, I., Alonso, I. G., Fajardo, V., Rodríguez, M. A., Hernández, P. E., García, T., Martín, R. (2005): Int Dairy J 15: 1122–1129.
22. López-Calleja, I., González, I., Fajardo, V., Martín, I., Hernández, P. E., García, T., Martín, R. (2005): J Dairy Sci 88: 3115–3120.
23. López-Calleja, I., González, I., Fajardo, V., Martín, I., Hernández, P. E., García, T., Martín, R. (2007): Int Dairy J 17: 729–736.
24. Lopparelli, R. M., Cardazzo, B., Balzan, S., Giaccone, V., Novelli, E. (2007): J Agric Food Chem 55: 3429–3434.
25. Macrina, F.L. (1995): Scientific Integrity: An Introductory Text with Ceses. ASM Press, Washington, DC.
26. Mafra, I., Ferreira, I. M. P. L. V. O., Beatriz, M., Oliveira, P.P. (2007): Food authentication by PCR-based methods. Universidado de Porto, Porto.
27. Mafra, I., Ferreira, I. M. P. L. V. O., Faria, M. A., Oliveira, B. P. P. (2004): J Agric Food Chem 52: 4943–4947.
28. Matsunaga, T., Chikuni, K., Tanabe, R., Muroya, S., Shibata, K., Yamada, J., Shinmura, Y. (1999): Meat Sci 51: 143–148.
29. Maudet, C., Taberlet, P. (2001): J Dairy Res 68: 229–235.
30. Meyer, R., Höfelein, C., Lüthy, J., Candrian, U. (1995): J AOAC Int 78:1542–1551.
31. Montiel-Sosa, J. F., Ruiz-Pesini, E., Montoya, J., Roncalés, P., López-Pérez, M. J., Pérez-Martos, A. (2000): J Agric Food Chem 48:2829–2832.
32. Pasqualone, A., Montemurro, C., Grinn-Gofron, A., Sonnante, G., Blanco, A. (2007): J Agric Food Chem 55: 3312–3318.
33. Regulation (EC) No 1829/2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September 2003 on genetically modiWed food and feed. OV J Eur Union L 268:1–23
34. Regulation (EC) No 1830/2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September 2003 concerning the traceability of food and feed products produced from genetically modiWed organisms and amending Directive 2001/18/EC. OV J Eur Union L 268:24–28
35. Russel, V. J., Pryde, S. E., Santos, A. T., Rosa, C., Quinteiro, J., Rey-Méndez, M. (2002): Eur Food Res Technol 214: 171–177.
36. Rønning, S. B., Rudi, K., Berdal, K. G., Holst-Jensen, A. (2005): J Agric Food Chem 53: 8874–8880.
37. Sanchez, S. (2006): Making PCR a normal routine of the food microbiology lab. The University of Georgia, Athens.
38. Stephan, O., Vieths, S. (2004): J Agric Food Chem 52: 3754–3760.
39. Wellinghausen. N., Wirths, B., Essig, A., Wassill, L. (2004): Evaluation of the Hyplex Bloodscreen multiplex PCR-enzyme-linked immunosorbent assay system for direct identification of gram-positive cocci and gram-negative bacilli from positive blood cultures. J. Clin.Microbiol. 43: 3147-3152.
40. Wolf, C., Lüthy, J. (2001): Meat Sci 57: 161–168.
41. Wolf, C., Rentsch, J. (1999): J Agric Food Chem 47: 1350–1355.
42.http://www.greenfacts.org/
43.http://www.celiac.org/
44.http://www.bio.davidson.edu/