Autor: dipl. biolog – master Vladimir Vukić
E-mail: vladimirvukic@gmail.com

.

Uvod

Mnoga istraživanja sprovedena su radi utvrđivanja toksičnih efekata cijanotoksina na ljudsko zdravlje i životnu sredinu. Rezultati tih istraživanja pokazala su visoku toksičnost cijanotoksina, usled čega su date preporuke i zakonske regulative dozvoljenih količina cijanotoksina u vodi, kao njihovom osnovnom izvoru. Međutim, obzirom da su cijanotoksini relativno novo polje istraživanja, podaci i regulative su prilično oskudni. Kao najveći nedostak može se navesti manjak preporuka i regulativa za dozvoljene količine cijanotoksina u hrani. Cilj ovog rada je da se preispita metodologija izračunavanja prepurečih dozvoljenih koncentracija mikrocistina-LR u vodi, data od strane Svetske zdravstvene organizacije (WHO) i pokušaju dati preporučene maksimalne doze cijanotoksina u hrani (oralni unos).

Fawel (1993) je histopatološkim i enzimološkim ispitivanjima ustanoio da oralni unos 40μg/kgtm/dan (tm- telesna masa) mikrocistina-LR u toku 13 nedelja nema štetnih efekata po zdravlje miša. Uzevši mikrocistin-LR kao najzastupljeniji i reprezentativni cijanotoksin, WHO je na osnovu iskazanih vrednosti odredila preporučeni dozvoljeni dnevni unos mikrocistina-LR u količini od 0,04μg/kgtm/dan. Vrednost je dobijena deljenjem 40μg/kgtm/dan sa 1000 (10 za intraspecijsku varijabilnost, 10 za interspecijsku varijabilnost i 10 za nedostatak podataka o hroničnom delovanju toksina).
Na osnovu ove vrednosti izračunata je i vrednost preporučene dozvoljene koncentracije mikrotoksina u pijaćoj vodi po formuli:

PDK = PDDUC x TM x P / L

Gde je:
PDK – preporučena dozvoljena koncentracija
PDDUC – preporuceni dozvoljeni dnevni unos cijanotoksina (0,04μg/kgtm/dan)
TM – telesna masa (60kg)
P – procenat unet putem vode (0,8)
L – količina unete vode (2L)

Dobijena vrednost iznosi 1μg/L (WHO, 1998). Tu vrednost WHO je označila kao koncentraciju koja neće dovesti do značajnih neželjenih efekata po ljudsko zdravlje, tokom životnog konzumiranja.

Preporučena dozvoljena količina cijanotoksina u hrani se može jednostavno izračunati analogno formulama datim od strane WHO. Međutim, pre toga, usled novih podataka i nedostatka preciznijih podataka, neophodno je ispitati adekvatnost ponuđenih formula, sve aspekte dejstva cijanotoksina na ljudsko zdravlje, kao i njihov kumulativni efekat.

Niz istraživanja koja su usledila nakon procene od strane WHO su ukazala, upotrebom naprednijih tehnika, na nedostatke date procene.

Osnovni nedostatak vrednosti datih od strane WHO predstavlja njihovo baziranje samo na jednom istraživanju dejstva cijanotoksina na sisare (miševe). Da bi se dobila što preciznija vrednst, neophodno je sprovesti više ispitivanja oralnog unosa cijanotoksina. Takođe, ispitivanja treba vršiti i na primatima i čoveku, kako bi se izbegle interspecijske varijacije.

WHO je u izveštaju navela postojanje indicija da cijanotoksini imaju teratogeni efekat, dok je mutageni efekat isključen na osnovu in vivo i in vitro istraživanja. Međutim, novija istraživanja su pokazala jasne in vivo teratogene i mutagene efekte mikrocistina-LR, kao najzastupljenijih cijanotoksina (Zhou, et al., 2002; Shen, et al., 2002, Svirčev, et al., 2009). Žegura et al., 2003, su pokazali da doze mikrocistina u vodi, koje su u dozvoljenom opsegu (0,01 – 1μg/mL), dovode do preloma DNK lanaca u ćelijama jetre.

WHO je procenu vršila na osnovu ispitivanja pojedinačnih toksina. Hemijsko-ekološka ispitivanja su pokazala da toksini imaju značajno jači efekat kada se nalaze u prirodnoj smeši, nego ukoliko su veštački pomešani (Paul, et al. 2001; Pietsch et al. 2001). S toga bi u procenu toksičnosti trebalo uključiti ovaj aspekt toksina i eksperimente vršiti sa grupnim ekstraktima. Takođe, WHO se oslanjala na in vitro ispitivanja najčešćih toksina kao što su mikrocistin-LR, anatoksin-a, anatoksia-a(S), nodularin, homoanatoksin, saksitoksin i cilindrospermopsin. Istaraživanja su pokazala da ovi toksini imaju više konenera koji pokazuju vrlo značajne razlike u toksičnom dejstvu. Neohodno je izvršiti dodatna ispitivanja koja će pokriti poznate kongenere i njihove mešavine. Takođe je potrebno izvršiti i ispitivanja novootkrivenih toksina kao što je β–N–methylamino–L–alanine (BMAA) i njihovih interakcija sa već poznatim toksinima.

Veoma veliki nedostatak za procenu dozvoljenih količina cijanotoksina u hrani čini manjak istraživanja oralnog unosa cijanotoksina. Ipak, istrživanja sprovedena na svinjama su pokazala da subhronično oralno konzumiranje mikrocistina-LR putem vode u količini od 100μg/kgtm/dan nemaju histopatoloških efekata (Hundell, 2008). Ovo ukazuje na veliku interspecijsku varijabilnost među sisarima koju treba uzeti u obzir pri određivanju dozvoljenih koncentracija cijanotoksina. Humpage i Falconer 2003, su otvrdili da hronična oralna doza cilindrospermopsina (u trajanju od 11 nedelja) od 30μg/kgtm/dan nema vidljivih štetnih efekata po organizam miša, dok je doza od 60μg/kgtm/dan bila letalna za miševe, što ukazuje da je ovaj toksin jači od mikrocistina-LR i da to treba utzeti u obzir prilikom procene dozvoljenih koncentracija cijanotoksina u vodi i hrani.

Zapaženo je da toksičnost cijanotokina zavisi i od pola, uzrasta i ishrane organizma koji je izložen njihovom delovanju, što je takođe potrebno uzeti u obzir pri davanju preporuke dozvoljene količine cijanotoksina u vodi i namirnicama. Odrasle jedinke pacova su oko 10 puta otpornije na oralni unos i dejstvo mikrocistina od tek rođenih pacova (Watts, et al., 1966). Sa druge strane, kod miševa su dobijeni suprotni reultati. Starije jedinke su bile nekoliko puta osetljivije od juvenilnih (Rao, et al., 2005).

Prilikom davanja procene, neophodno je uzeti u obzir i činjenicu da ne postoji lek od trovanja cijanotoksinima i da se lečenje svodi na samoregeneraciju organizma (sisarskoj jetri (pacov) porebno oko 2 meseca da se potpuno oporavi od dejstva mikrocistina (Andrinolo, et al., 2008)), što ostavlja znatno veće posledice po organizam, nego u slučaju protivotrova, jer se produžava dejstvo doze.

Veoma važan aspekt pri davanju procene dozvoljene dnevne doze za cijanooksine je mogućnost njihove akumulacije u hrani putem lanaca ishrane, kao i duzina izloženosti toksinima. Hawkins, at al., 1997 su pokazali da se akutna LD50 (Lethal Dose 50 – Količina toksina koja je letalna za 50 odsto jedinki) tokom svega 5 dana smanji 10 puta. Neki cijanotoksini (BMAA) kao i većina toksina, akumuliraju se u lancima ishrane, što ih čini još opasnijim po biosferu i čoveka koji se nalazi na njenom vrhu (Cox et al. 2003; Cox et all, 2005). Iako postoje podaci da i drugi cijanotoksini pokazuju sličan trend (Li et al. 2004; Sipia et al. 2001; Xie et al., 2005), njihova relevantnost se dovodi u pitanje zbog korišćene metodologije zaključivanja i rezultata koji pokazuju oprečne podatke, posebno sa mikrocistin (De Maagd, et al., 1999; Ibelings, et al., 2005).

Veliki nedostatak su podaci o delovanju cijanotoksina na ljude. U dosadašnjim istraživanjima uglavnom se baziralo na merenju oštećenja jetre ili eventualno primitivnih nefrosa zivotinja kao što su ribe, račići i slično. Ipak, opažanje svih neželjenih efekata je vrlo ograničeno kod tako primitovnih organizama. S obzirom da cijanotoksini pored hepatotoksinima pripadaju i neurotoksinima i endotoksinima i da prolaze kroz krvno moždanu barijeru, oštećuju oči, kožu, respiratorne organe, creva, itd, kod ljudi oštećenja mogu imati raznvrsne fiziološke ili psihološke posledice koje nisu do sada istraživane u hroničnim delovanjima malih doza cijanotoksina (Hundell, 2008).

Mnoge države među kojima prednjači Australija (usled zabeleženih loših iskustava sa cijanotoksinima) su vođene preporukom WHO i sopstvenim istraživanjima odredile dozvoljene koncentracije cijanotoksina u vodi za poće. Tako je Australija odredila vrednost od 1,3μg/L svih cijanotoksina, Kanada 1,5μg/L, dok je Brazil dao odvojene vrednosti za: mikrocistin-LR – 1μg/L, saksitoksin – 3μg/L i cilindrospemopsin 15μg/L (NHMRC/NRMMC, 2004; Health Canada, 2002; Codd et al., 2005)

WHO je pretpostavila da se glavni unos cijanotoksina odvija putem pijaće vode. Međutim, u proceni dozvoljne količine cijanotoksina u vodi i hrani, treba uzeti u obzir kumulativni efekat iz svih mogućih izvora kontaminacije. U obzir posebno treba uzeti osobe (populacije) koje se pretežno hrane ribom ili algama. Pored vode i hrane, izvor cijanotoksina može biti i voda za tuširanje koja u organizam ulazi putem kože ili razne kreme i preparati na bazi algi. S obzirom da nedostaju podaci o količini cijanotoksina u prehrambenim proizvodima, veoma teško je pretpostaviti koliki je udeo tako unetih cijanotoksina.

Iako je krajnji zaključak da nedostaje velika količina podataka da bi se dao zadovoljavajući odgovor na pitanje koji je unos cijanotoksina bezbedan po ljudsko zdravlje, ipak ćemo pokušati da damo neki odgovor.

Na osnovu svega iznetog, može se ukazati na nedostatak formule za izračunavanje dozvoljene količine cijanotoksina, jer nije uzeto u obzir dovoljno parametara magnifikacije. Smatramo da je broj 40 μg/kgtm/dan potrebno najmanje podeliti sa 100000 čime bi se dobila vrednost od 0,0004 μg/kgtm/dan za ukupne cijanotoksine. Dodatni faktor 100 predlažemo usled podataka o novootkrivenim cijanotoksinima i njihovim pojedinačnim i grupnim efektima, polno i uzrasno zavisnim efektima cijanotoksina, malih fizioloških i psiholoških efekata na ljude i kancerogenom i mutagenom dejstvu cijanotoksina, kao i nedostatku podataka o zadržavanju cijanotoksina u organizmu.

S obzirom da kancerogena jedinjenja nisu dozvoljena u ishrani ljudi, ne bi se smeli nalaziti u hrani, ali smatramo da to je to praktično vrlo teško izvodljivo, usled čega smo se odlučili za datu minimalnu vrednost.

Ukoliko promenjene vrednosti unesemo u formulu datu od WHO, dobićemo:

Dozvoljena količina = PDDUC x TM x P / L

Gde je:
PDK – preporučena dozvoljena koncentracija
PDDUC – preporučeni dozvoljeni dnevni unos cijanotoksina (0,0004μg/kgtm/dan)
TM – telesna masa (60kg)
P – procenat unet putem vode (0,4)
L – količina unete vode (2L)

Dibijena vrednost iznosi približno 0,005 μg/L, što je trenutno ispod nivoa detekcije (Hundell, 2008).

Dietrich i Hoeger su 2005 ukazali da se predložene dozvoljene vrednosti od strane WHO za mikrocistin mogu vrlo lako preći konzumiranjem kontaminirane hrane dostupne na tržištu. Vođeni ovim problemom i usled neophodnosti za strožijom kontrolom količina cijanotoksina u hrani, prateći prethodni primer, izrazili smo formulu za izračunavanje preporučenih dozvoljenih količina cijanotoksina u hrani:

Dozvoljena količina = PDDUC x TM x P / Kg

Gde je:
PDK – preporučena dozvoljena koncentracija
PDDUC – preporuceni dozvoljeni dnevni unos cijanotoksina (0,0004μg/kgtm/dan)
TM – telesna masa (60kg)
P – procenat unet putem vode (0,4)
L – količina unete vode (1Kg)

Dobijeni rezultat iznosi 0,01 μg/Kg, što je na limitu detekcije (Hundell, 2008).
.

Zaključak

Prisustvo cijanotoksina u vodi za piće i hrani predstavlja pretnju po ljudsko zdravlje. Uslede toga neophodna je strožija kontrola njihovog prisustva i preciznija zakonska regulativa. Preporučenu dnevnu dozvoljenu dozu unosa cijanotoksina data od strane Svetske zdravstvene organizacije (WHO) neophodno je modifikovati usled novih podataka o štetnim dejstvima cijanotoksina. Nova preporučena dozvoljena doza treba da iznosi 0,005μg/L za pijaću vodu, dok za hranu treba da iznosi 0,01 μg/Kg.
.

Literatura

1. Dietrich D, Hoeger S (2005) Toxicol Appl Pharmacol 203 273
2. Fawell, J.K. 1993 Toxins from blue-green algae: toxicological assessment of microcystin-LR Volume 4. Microcystin-LR: 13 week oral (gavage) toxicity study in the mouse (final report), Water Research Centre, Medmenham, UK, 1-259.
3. Fawell, J.K., James, C.P. and James, H.A. 1994 Toxins from Blue-Green Algae: Toxicological Assessment of Microcystin-LR and a Method for its Determination in Water, Water Research Centre, Medmenham, UK, 1-46.
4. World Health Organization (1998) Guidelines for Drinking-water Quality. Second Edition, Addendum to volume 2, Health criteria and other supporting information. World Health Organization, Geneva.
5. Zhou, L., Yu, H., Chen, K., 2002. Relationship between microcystin in drinking water and colorectal cancer. Biomed. Environ. Sci. 15 (2), 166–171.
6. Zorica Svircev, Svetislav Krstic, Marica Miladinov-Mikov, Vladimir Baltic and Milka Vidovic (2009): Freshwater Cyanobacteria Blooms and Primary Liver Cancer Epidemiological Studies in Serbia. Journal of Environmental Science and Health Part C, 27, 36–55.
7. Shen XY, Lam PKS, Shaw GR, Wickramasinghe W (2002): Genotoxicity investigation of a cyanobacterial toxin, cylindrospermopsin. Toxicon 40: 1499- 1501.
8. Paul VJ, Cruz-Rivera E, and Thacker RW (2001) Chemical mediation of macroalgal- herbivore interactions: ecological and evolutionary perspectives. In: Marine Chemical Ecology, McClintock JB & Baker BJ, eds., pp. 227-265.
9. Pietsch C, Wiegand C, Ame MV, Nicklisch A, Wunderlin D, Pflugmacher S (2001) The effects of a cyanobacterial crude extract on different aquatic organisms: Evidence for cyanobacterial toxin modulating factors. Environ Tox 16: 535-542.
10. Bojana Žegura, Bojan Sedmak and Metka Filipič (2003): Microcystin-LR induces oxidative DNA damage in human hepatoma cell line HepG2. Toxicon.
11. Volume 41, Issue 1, January 2003, Pages 41-48.
12. Darío Andrinolo, Daniela Sedan, Luis Telese, Claudia Aura, Silvia Masera, Leda Giannuzzi, Carlos Alberto Marra and María J.T. de Alaniz (2008): Hepatic recovery after damage produced by sub-chronic intoxication with the cyanotoxin microcystin-LR. Toxicon. Volume 51, Issue 3, 1 March 2008, Pages 457-467
13. Hawkins PR, Chandrasena NR, Jones GJ, Humpage AR, Falconer IR (1997) Isolation and toxicity of Cylindrospermopsis raciborskii from an ornamental lake. Toxicon 35(3):341–346.
14. Watts JS, Reilly J, DaCosta FM, Krop S (1966) Acute toxicity of paralytic shellfish poison in rats of different ages. Toxicol Appl Pharmacol 8(2):286–294
15. Rao PVL, Gupta N, Jayaraj R, Bhaskar ASB, Jatav PC (2005) Age–dependent effects on biochemical variables and toxicity induced by cyclic peptide toxin microcystin–LR in mice. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 140(1):11–19.
16. Humpage AR, Falconer IR (2003) Oral toxicity of the cyanobacterial toxin cylindrospermopsin in male Swiss albino mice: Determination of no observed adverse effect level for deriving a drinking water guideline value. Environ Toxicol 18: 94-103
17. Li XY, Chung IK, Kim JI, Lee JA (2004) Subchronic oral toxicity of microcystin in common carp (Cyprinus carpio L.) exposed to Microcystis under laboratory conditions. Toxicon 44(8): 821–827
18. Sipia V, Kankaanpaa H, Lahti K, Carmichael WW, Meriluoto J (2001a) Detection of Nodularin in flounders and cod from the Baltic Sea. Environ Toxicol 16(2): 121–126
19. Xie LQ, Xie P, Guo LG, Li L, Miyabara Y et al. (2005) Organ distribution and bioaccumulation of microcystins in freshwater fish at different trophic levels from the eutrophic Lake Chaohu, China. Environ Toxicol 20(3): 293–300.
20. Cox PA, Banack SA, Murch SJ (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100 13380.
21. Cox PA, Banack SA, Murch SJ, Rasmussen U, Tien G, Bidigare RR, Metcalf JS, Morrison LF, Codd GA, Bergman B (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102 5074.
22. De Maagd PGJ, Hendriks AJ, Seinen W, Sijm D (1999) pH–dependent hydrophobicity of the cyanobacterial toxin microcystin–LR. Water Res 33:677–680
23. Ibelings BW, Bruning K, de Jonge J, Wolfstein K, Pires LMD, Postma J, Burger T (2005). Distribution of microcystins in a lake food web: No evidence for biomagnification Microb Ecol 49:487–500
24. NHMRC/NRMMC (2004) Australian Drinking Water Guidelines. National Health and Medical Research Council/Natural Resource Management Ministerial Council, Canberra. Available at: http://www.nhmrc.gov.au/publications/
25. Health Canada (2002): Guidelines for Canadian Drinking Water Quality: Supporting Documentation — Cyanobacterial Toxins — Microcystin-LR. Water Quality and Health Bureau, Healthy Environments and Consumer Safety Branch, Health Canada, Ottawa, Ontario. Available at: http://www.hcsc.gc.ca/
26. Codd GA, Azevedo SMFO, Bagchi SN, Burch MD, Carmichael WW, Harding WR, Kaya K, Utkilen HC, (2005) CYANONET, a Global Network for Cyanobacterial Bloom and Toxin Risk Management: Initial Situation Assessment and Recommendations. UNESCO IHP-VI.
27. Hundell, H. K., (2008): Cyanobacterial Harmful Algal Blooms: State of the Science and Research Needs. United States Environmental Protection Agency Triangle Park, NC, USA. Vol. 619.