Autor: Dipl. ing. Jovana Matić

.
Sva bazična ispitivanja u virologiji uvek počinju ispitivanjem osetljivosti virusa prema fizičkim i hemijskim faktorima i poređenjem virusnih porodica po ovim kriterijumima. Praktična primena tih saznanja koristi se za konzerviranje i čuvanje virusa, prečišćavanje virusnih suspenzija, dezinfekciju pri radu sa virusnim materijalom, kao i za primenu virusnih antigena i vakcina. Virusi nastanjuju vodenu sredinu (mora, okeane, reke, jezera), zemljište, vazduh, tkiva biljaka, životinja, ljudi; dakle virusi su svuda prisutni i iz tog razloga se moraju poznavati fizički i hemijski faktori koji nam pomažu u sprečavanju, ali i lečenju virusnih infekcija.

Uticaj temperature
Svi virusi mogu da prežive samo u određenim temperaturnim intervalima, za neke viruse ti intervali mogu biti jako uski, dok za neke druge viruse oni mogu biti široki nekoliko desetina °C. Zagrevanjem virusne suspenzije (inokuluma) na raznim temperaturama u određenom trajanju (obično 10 min.) utvrđuje se temperaturna vrednost na kojoj virus izgubi svoju infektivnost. Ta se vrednost označava kao termalna tačka inaktivacije. Ona, prema tome, predstavlja najnižu temperaturu na kojoj prestaje infektivna sposobnost virusa. Na primer za biljne viruse termalna tačka inaktivacije kreće se obično između 45oC (virus bronzavosti paradajza) i 90oC pa čak i 95oC (sojevi virusa mozaika duvana), ali većinom se nalazi između 55o i 70oC. Termalna tačka inaktivacije može se razlikovati i kod pojedinih sojeva iste vrste virusa. Tako kod soja B virusa nekroze duvana ona iznosi između 80-85oC, kod soja A 85-90oC, a kod sojeva C i D kreće se izmeću 90 i 95oC.

Uticaj povišene temperature na viruse je u većini slučajeva nepovoljan, a osetljivost virusa na visoke temperature zavisi od:

• osetljivosti proteina
• osetljivosti nukleinskih kiselina
• visine temperature
• vremena trajanja povišene temperature
• sastava suspenzije u kojoj je virus (prisustva vode, pH, belančevina, lipida, soli, MgCl2, Na2SO4…)

Toplotna inaktivacija i denaturacija virusnih proteina dešava se pri manjem povećanju temperature, nego denaturacija nukleinskih kiselina. Postepenim zagrevanjem virusi prvo gube moć razmnožavanja, a zatim infektivnu moć, antigenost i imunogenost, što je iskorišćeno kod pravljenja vakcina. Temperatura od 60°C u trajanju od 30 minuta uništava sposobnost razmnožavanja, infektivnost i antigenost većine virusa. Izuzeci su, na primer, virus hepatitis A i B, za čiju je inaktivaciju potrebno delovanje temperature od 60°C u trajanju od čak deset sati, a na temperaturi od 100°C u trajanju od 10 minuta i dalje zadržava antigenske osobine.

Osetljivost virusa na povišene temperature može se smanjiti dodavanjem bivalentnih katjona MgCl, Na2SO4 ili MgSO4. Ova osobina bivalentnih katjona koristi se za pripremu i čuvanje vakcina koje se koriste u tropskim predelima.

Snižavanje temperature ne odražava se štetno na viruse. Niske temperature imaju “konzervišući” efekat na viruse. Na primer, bolesnički material, u kome se očekuje da ima virusa, transportuje se u virusološku laboratoriju na temperaturi od 0°C (na lomljenom ledu), jer ova temperatura stabilizuje njihovu aktivnost. Snižavanje temperature za svakih 10°C doprinosi da se biohemijske reakcije odigravaju dva puta sporije, što otprilike dvostruko produžava preživljavanje virusa. Smrzavanje virusa na temperature niže od -70°C služi za čuvanje virusnog materijala.Većina virusa se na taj način može održati više godina. Međutim, virusi koji sadrže lipoproteinsku ovojnicu,gube zaraznost nakon dužeg čuvanja, čak i pri ovako niskim temperaturama, zato se oni stabilizuju uz dodatak 5% dimetil sulfoksida. Virusi sa lipoproteinskim omotačem su posebno osetljivi na naizmenično smrzavanje i odmrzavanje. Ponovljeno smrzavanje i odmrzavanje u kratkom vremenskom intervalu utiče više ili manje štetno na biološke aktivnosti većine virusa, mada ima i onih virusa koji su otporniji na ovakve postupke. Znatan uticaj na osetljivost virusa ima i brzina smrzavanja i odmrzavanja, učestalost ovih postupaka, kao i sastav sredine u kojoj su virusi suspendovani.

Većina virusa na sobnoj temperature preživi samo nekoliko dana (2-3 dana).

Uticaj sušenja
Na temperaturama iznad 0°C, pri normalnom ili povišenom pritisku, mnogi virusi su osetljivi na sušenje-dehidrataciju (poliovirus, coxsackie virus), dok neki virusi (virus variolae, virus vacciniae) mogu mesecima zadržati svoju biološku funkciju u osušenom stanju. Za konzervisanje virusa koristi se i liofilizacija, sušenje na niskim temperaturama (smrzavanje i isparavanje leda) u vakuumu. Ovako pripremljen virusni materijal može godinama da zadrži svoju biološku aktivnost, ukoliko je optimalan pH, dovolnja količina vode (što zavisi od virusa) i ukoliko su materijalu dodati sastojci koji štite viruse ( neki koloidi, serum, plazme…)

Uticaj jonizujećeg zračenja
Jonizujuće zračenje inaktiviše viruse, ali ne uništava njihovu antigenost, pa se ovaj postupak primenjuje u proizvodnji virusnih vakcina. Jonizujuće zračenje koristi se i za sterilizaciju namirnica i prostorija kontaminiranih virusima. Pod dejstvom jonizujućeg zračenja dolazi do prekidanja virusne nukleinske kiseline. Viruse sa jednolančanom nukleinskom kiselinom, jonizujuće zračenje u potpunosti inaktiviše, a kod dvolančanih virusa inaktivacija je delimična, jer zračenje uglavnom zahvati samo jedan lanac.

Ultraljubičasti zraci-UV
Na delovanje UV(200-300nm) zraka osetljiviji su virusi od vegetativnih bakterija. UV zraci inaktivišu viruse, izazivajući promene u purinskim i pirimidinskim bazama nukleinskih kiselina. Susedne baze istog nukleotida vezuju se kovalentnim vezama u dimere (timin-timin, citozin-citozin…) i tako se oštećuje struktura nukleinske kiseline i zaustavlja se razmnožavanje virusne čestice. Oštećenja virusnih nukeinskih kiselina UV zracima mogu biti reverzibilna, ako se virus, izložen dejstvu ovih zraka, nalazi u osetljivoj ćeliji. Pod dejstvom dnevne svetlosti aktivira se enzim u ćeliji, koji cepa stvorene dimere. Ovakva fotoreaktivacija virusa nije moguća ukoliko se virus nalazi van ćelije.
UV zraci se koriste za sterilizaciju prostorija, laboratorijskog i drugog pribora, kao i za proizvodnju vakcina.

Ultrazvuk
Zvučni talasi frekvence preko 20000Hz mehaničkim delovanjem ireverzibilno inaktivišu virus, ali njegova antigenost ostaje očuvana. Ovaj postupak se može koristiti u pripremi virusnih vakcina i antigena.

Indukovana fotodinamička inaktivacija
Neke boje (neutralno crveno, toluidin, proflavi) mogu se vezati za nukleinske kiseline virusa, čineći ih osetljivim na svetlo i inaktivišući ih reverzibilno.

pH
Virusi su stabilni pri pH 5-9, sa izuzetkom enterovirusa koji mogu zadržati infektivnost i u veoma kiseloj sredini, pri pH 2.

Hemijske supstance
Osetljivost virusa prema različitim hemijskim supstancama zavisi od hemijskog sastava, odnosno, građe virusa, pa se osetljivost virusa na nake hemijske supstance koristi i kao kriterijum u klasifikaciji virusa.

Fenol :virusi su otporniji prema fenolu od vegetativnih oblika bakterija. Fenol denaturiše virusne proteine, ne oštećujući nukleinsku kiselinu.
Formaldehid inaktiviše viruse, ne oštećujući njihove antigenske osobine. Inaktivacija zahvata i virusne proteine i nukleinsku kiselinu. Dolazi do reakcije sa amino grupama proteina i amino grupama baza nukleinskih kiselina. Formaldehid se koristi u koncentracijama od 0,2 do 0,5% za pripremanje vakcina.
Azotasta kiselina deluje na baze nukleinskih kiselina, pretvarajući amino grupe u hidroksilne. Pored inaktivacije virusa, azotasta kiselina može dovesti i do promena u sekvencama baza, što izaziva virusne mutacije.

Oksidaciona sredstva : virusi su osetljiviji prema oksidacionim sredstvima od vegetativnih oblika bakterija. H2O, KMnO4 i preparati hlora inaktivišu viruse, pa se koriste kao dezinficijensi u svim virusološkim laboratorijama. Glavni činilac u inaktivaciji virusa pri upotrebi dezinfekcionih sredstava sa hlorom je hipohlorna kiselina, koja oštećuje adenin-, citozin-, i guanin-monofosfat, pri odrećenim vrednostima pH.

Organski rastvarači : osetljivost virusa pema etru jedan je od kriterijuma u njihovoj klasifikaciji, s obzirom da ova osetljivost zavisi od građe, odnosno, od hemijskog sastava virusa. Svi virusi koji sadrže lipoproteinski omotač, osetljiviji su prema delovanju etra, Na-dezoksihlorata i raznih organskih rastvarača. Virusi koji imaju samo nukleokapsid, otporni su prema etru i organskim rastvaračima. Prema nižim koncentracijama alkohola, hloroformu i acetonu, virusi su otporniji od vegetativnih oblika bakterija.

Deterdženti imaju sposobnost da razgrade virusne čestice, pa se neki od njih upotrebljavaju za dezinfekciju u virusološkim laboratorijama. Oni se vezuju na proteine virusa i razgraćuju ih na polipeptidne lance i tako dezintegrišu virusnu česticu.
Etilenoksid efikasno inaktiviše viruse, reagovanjem sa karboksilnom grupom belančevina.
.

Literatura

1. Arvin, A. M.; Greenberg , H.B.( 2006).: New viral vaccines. Virology 344(1):240.
2. Bidawid, S., Farber, J. M. and Sattar, S.A. (2001): Survival of hepatitis A virus on modified atmosphere-packaged (MAP) lettuce. Food Microbiol. 18, 95-102.
3. Bosh, A., Pinto, R.M., Villena, C., Abad, F. X. (1997): Persistence of human astrovirus in fresh and marine water. Water Sci. Technol. 35, 243-247.
4. Enriquez, C. E., Hurst, C.J., Gerba, C. P. (1995): Survival oh human enteric adenoviruses 40 and 41 in tap, sea, and waste water. Water Res. 29, 2548-2553.
5. Greening, G.E., Dawson, J., Lewis, G. (2001): Survival of poliovirus in New Zeland green lipped mussels, Perna canaliculus, on refrigerated and frozen storage. J. Food Protect. 64, 881-884.
6. Hurst, C. J., Benton, W. H., McClellan, A. (1989): Thermal and water source effects upon the stability of enteroviruses in surface freshwaters. Can. J. Microbiol. 35, 474-480.
7. Koopmans, M., Duizer, E., (2004): Foodborne viruses: an emerging problem, International Journal of Food Microbiology 90 (2004), 23 – 41.
8. Krstić, Lj, (1995) : Medicinska virusologija, Zavod za udžbenike i nastavna sredstva Beograd.
9. O`Mahony, J., O`Donoghue, M., Morgan, J.G. and Hill. C. (2000): Rotavirus survival and stability in foods as determined by an optimised plaque assaz procedure. Int. J. Food Microbiol. 61, 177-185.
10. Patić-Jerant, V. (1995): Medicinska virusologija, Zavod za udžbenike i nastavna sredstva Beograd.
11. Rede, R. R., Petrović, S. P. (1997): Tehnologija mesa i nauka o mesu; Tehnološki fakultet, Novi Sad.
12. Šutić, D. (1995): Viroze biljaka, Institut za zaštitu bilja i životnu sredinu, Beograd.
13. Šutić, D., Ranković, M. (1981): Otpornost nekih kultivara šljive, breskve i kajsije prema virusu šarke. IV kongres mikrobiologa Jugoslavije, 22-25. septembar, Beograd.
14. Tiron, S.V. (1992): Field and laboratory studies related to the persistence, survival and inactivation of enteroviruses in some foods: In Proceedings of the Third Word Congress on Foodborne Infections and Intoxications, Vol. 1. 298-303.
15. Vrbaški, Lj., (1993) : Mikrobiologija, Prometej Novi Sad.
16. Ward, B. K. And Irving, L.G. (1997): Virus survival on vegetables spray-irrigated with wastewater. Water Res. 21, 57-63.
17. www.cem-gornestaze.cg.yu/zoonoze
18. www.well.org.yu
19. www.who.int/foodsafety
20. www.wikipedia.com
21. www.pathmicro.med.sc.edu/virol
22. www.fags.org