Autor: dipl. ing. Maja Deak
Recezent: prof. dr Biserka Vujičić

Visokopritisna tečna hromatografija (HPLC – High Pressure Liquid Chromatography) ređe se označava i kao visokoperformantna tečna hromatografija (HPLC – High Performance Liquid Chromatography).

Kvantitativno određivanje vitamina C HPLC analizom uključuje pripremu uzoraka, ekstrakciju, saponifikaciju (ili bez), HPLC razdvajanje, identifikaciju pikova i kvantifikaciju (Marjanović, Krstić, 1998).

Slika 3. Šema aparature za HPLC (Marjanović, Krstić, 1998).

Sa R je označen rezervoar za rastvarač ili eluent (smešu rastvarača), koji za upotrebu u HPLC mora biti bez čvrstih suspendovanih čestica i bez rastvorenog gasa. Čvrste čestice se uklanjaju filtracijom kroz ultrafiltre, dok se rastvoreni gasovi uklanjaju ključanjem u vakuumu, uz pomoć ultrazvuka ili barbotiranjem helijuma. Filter F služi za uklanjanje slučajno prisutnih čvrstih čestica prečnika oko 10 μm. Pumpa PU služi da se obezbedi ulazni pritisak mobilne faze, najčešće između 30 i 300 bar, uz odgovarajući protok kroz hromatografski sistem (oko 1 ml/min). Najčešće su u upotrebi klipne pumpe sa linearnim (jednosmernim) ili naizmeničnim kretanjem klipa. Upotreba pumpi sa naizmeničnim kretanjem klipa ima jedan nedostatak, a to je pulsiranje pritiska, odnosno protoka. Zbog toga se neposredno iza pumpe ugrađuje prigušivač oscilacija (PO).

M predstavlja manometar za merenje ulaznog pritiska, a DR ventil za ispuštanje nepotrebne tečnosti (drain) i za uklanjanje gasa iz prethodno opisanih delova. Injektor (I) predstavlja kritični deo aparature za HPLC jer treba da omogući unošenje uzorka pri visokom unutrašnjem pritisku bez promene režima strujanja (protoka). Pri nižim ulaznim pritiscima (do 70 bar) može se koristiti rešenje sa septumom, dok se za više pritiske koristi rešenje kao što je gasna slavina, koja se pomera ručno ili pomoću elektromagneta ili pneumatskog izvršnog organa. Može se koristiti i rešenje u kombinaciji septuma i gasne slavine.

Najčešća zapremina probe je 10-50 μl. Pretkolona (PK) ima iste karakteristike kao kolona i zadatak joj je da ukloni nečistoće unete sa uzorkom i na taj način spreči začepljenje kolone. Pretkolone obično imaju dužinu od nekoliko cm.

Kolona (K) može biti izrađena od stakla (ređe), nerđajućeg čelika ili tantala. Na oba kraja kolone nalaze se proširenja na kojima je narezan navoj na koji se navrće posebna navrtka (nut) namenjena za spajanje kolona sa metalnim kapilarama za dovod i odvod tečnosti. Ove navrtke takođe služe za učvršćivanje sita na početku i kraju kolone koja služe za uklanjanje grubih nečistoća i kao porozni čep pri punjenju kolone.

Detektor (D) služi za prevođenje signala mase (koncentracije) u električni signal, koji se zatim pojačava, moduliše i meri (registruje). Najčešće su u primeni UV-detektori (zasnovani na apsorpciji zračenja iz UV i vidljive oblasti elektromagnetnog spektra), slabije detektori na bazi merenja fluorescencije, indeksa refrakcije, elektrohemijski i ostali. UV detektori mere apsorbanciju pri konstantnoj talasnoj dužini (ili rasponu talasnih dužina) koristeći protočne kivete kroz koje protiče eluat (rastvarač + komponenta) i eluent (rastvarač). Kako je apsorbancija data izrazom:

A = e x l x c

gde je: ε-koeficijent apsorbancije; l-debljina sloja i c-koncentracija, to se osetljivost ovih detektora povećava isključivo konstrukcijama koje omogućavaju veću dužinu (l), jer se na ostale veličine ne može uticati (ε, c).

Praktično se grade kao fotometri ili spektrofotometri. Novije konstrukcije ovog detektora omogućavaju neprekidno merenje (snimanje) apsorpcionog spektra supstance (diode array) što ove detektore čini izuzetno pogodnim za kvalitativnu, a pogotovu kvantitativnu analizu. Osetljivost ovih detektora je 10^-10 g/ml.

U detektoru nastaje električni signal saglasan koncentraciji ispitivane komponente koji se pojačava (oslabljuje) i zatim zapisuje potenciometrijskim kompenzacionim pisačem (P) ili se analogni električni signal prevodi u digitalni i zatim mu je put, odnosno obrada, definisana digitalnim hardverom i softverom (računarskom tehnikom), pri čemu su dominantne funkcije merenja vremena izlaska pikova (maksimuma) i merenja površine pikova (integracija). Kada je reč o računarima u sklopu instrumentacije HPLC-a, oni im elucionih vremena, integracije pikova uz dodatno računanje udela komponente na bazi funkcije zavisnosti površine od količine (definisane na bazi standarda). Tumačenje rezultata bez upotrebe računara pre svega obuhvata kvalitativnu analizu (na osnovu elucionih (retencionih) vremena uz definisanje intervala poverenja) i kvantitativnu analizu (na osnovu površina zahvaćenih pikovima uz prethodno eksperimentalno definisanje funkcije zavisnosti površine od koncentracije različitim metodama).

Korišćen je HPLC-UV-DAD sistem. Nepokretna faza je bila C-18 kolona (Agilent, SAD), a pokretna rastvor amonijum-acetata. pH 5,1 koncentracije 0,1mol/l, i protoka 0,4 ml/min. Ove faze su izabrane sa zvaničnog sajta firme Merck, Nemačka.

Sadržaj vitamina C je određen u sve četiri serije uzoraka, koji su prečišćavani aktivnim ugljem i silika gelom.

Utvrđivanje sadržaja vitamina C je izvedeno na sledeći način: prvo je iz hromatograma očitavana površina ispod pika supstance, a potom je proporcijom pomoću standarda vitamina C određivana koncentracija vitamina u supstratima.

Standard vitamina C je koncentracije 103 μg/ml, i površine A_{sr(standarda)}=12923

gde je:

C_standarda – koncentracija vitamina C u standardnom rastvoru, μg/ml
C_uzorka – koncentracija vitamina C u uzorcima supstrata, μg/ml
A_{sr(standarda)} – površina ispod pika hromatograma za vitamin C u standardu
A_sr(uzorka) – površina ispod pika hromatograma za vitamin C u uzorcima supstrata