U ovoj monografiji su predstavljeni rezultati višegodišnjeg rada i istraživanja saradnika Instituta za higijenu i tehnologiju mesa, Beograd, u oblasti tehnološke mikrobiologije i bezbednosti tradicionalnih fermentisanih proizvoda od mesa.

Opredeljenje za ovu oblast naučnog i istraživačkog rada autoru je predstavljao međunarodni naučno-istraživački projekat: „Safety of traditional fermented sausages: Research on protective cultures and bacteriocins“, koji je finansiran iz fonda Evropske unije.

Angažovanje autora u ovom međunarodnom projektu, gde je bio nosilac četvoro-godišnjih mikrobioloških aktivnosti, omogućilo je nastavak daljih istraživanja u oblasti izolacije i karakterizacije bakterija mlečne kiseline (BMK) i utvrđivanja njihove sposobnosti da produkuju bakteriocine. Posebno je od značaja iznalaženje načina za purifikaciju ovih antimikrobnih metabolita, kao i mogućnosti za njihovu primenu u toku proizvodnje fermentisanih kobasica, u cilju dobijanja zdravstveno bezbednih proizvoda.

Danas, autor je rukovodilac trogodišnjeg naučno-istraživačkog projekta (ev. broj ugovora: TR-20127, koga finansira Ministarstvo nauke Republike Srbije) „Tehnološke i protektivne osobine autohtonih sojeva bakterija mlečne kiseline izolovanih iz tradicionalnih fermentisanih kobasica i mogućnost njihove primene u industriji mesa“. U njemu su dalje izučene najvažnije osobine izolovanih sojeva BMK iz fermentisanih kobasica, proizvedenih po tradicionalnim tehnologijama, u porodičnim domaćinstvima i u industrijskim uslovima. Sakupljena je kolekcija od 450 autohtonih sojeva BMK i ispitana je mogućnost njihovog korišćenja u procesima proizvodnje fermentisanih kobasica, kao starter kultura ili kao producenata bakteriocina.

S obzirom na to da BMK imaju esencijalnu ulogu u toku nastanka fermentisanih proizvoda od mesa, tj. da svojom metaboličkom aktivnošću utiču na procese zrenja, uz istovremeno inhibiranje rasta neželjenih mikroorganizama, od značaja je bilo sabrati deo dosadašnjih iskustava i saznanja iz ove oblasti i predstaviti ih onima koji se, na bilo koji način, bave ovom problematikom.

Prateći savremene koncepte proizvodnje, prerade i pakovanja, autor je pokušao da svojim istraživanjima da doprinos razvoju novih zaštitnih tehnologija, čija bi primena mogla doprineti nastanku zdravstveno bezbednih proizvoda, kao i prihvatljivog, i pri tom nepromenjenog, kvaliteta od momenta proizvodnje do momenta konzumiranja.

Uprkos činjenici da se sličan uspeh, od otkrića i primene nizina, još uvek nije pono-vio, autor sa svojim saradnicima ostaje u ubeđenju da se bakteriocini mogu eksploatisati, kao bioprotektori, u proizvodnji fermentisanih proizvoda od mesa. U nameri da se potpuno realizuje ovaj potencijal, neophodno je da se shvati priroda bakteriocina, da se razjasni veza između njihove strukture i funkcije, produkcije, imuniteta, regulacije i mehanizma delovanja.

Na ovaj način, želja mi je da se posebno zahvalim svima onima koji su pomogli da ova monografija ugleda svetlost dana.

Pre svih, to je profesor dr Dragojlo Obradović, koji me je uveo u svet bakterija mlečne kiseline, i koji me je u proteklih osam godina, svojom stručnom i mentorskom pomoći, vodio kroz polje nauke. U isto vreme, to je čovek koji je uvek, ljudskim odnosom i razumevanjem, davao podstrek za nastavak daljih usavršavanja iz oblasti tehnološke mikrobiologije, ali i prevazilaženju određenih izazova u profesionalnom i ličnom životu.

Zahvalnost dugujem i recenzentima ove knjige, dr Lazaru Turubatoviću, direktoru Instituta za higijenu i tehnologiju mesa Beograd, koji je prepoznao potrebu da se ova i slična istraživanja nastave u Institutu i nakon završetka projekta.

Posebnu zahvalnost dugujem dr Radetu Tadiću, koji mi je tokom zajedničkog rada nesebično prenosio svoje ogromno znanje i iskustvo i uvek pomagao da se izaberu uspešna rešenja u nauci i praksi, a koja se tiču higijene i tehnologije mesa.

Zahvalnost dugujem dr Vladu Teodoroviću, profesoru Veterinarskog fakulteta Univerziteta u Beogradu, čije je područje naučnog interesovanja, još dok sam bila student Veterinarskog fakulteta, postalo moje, danas.

Zahvalnost dugujem dr Mariji Škrinjar, profesoru Tehnološkog fakulteta Univerziteta u Novom Sadu, koja je tokom višegodišnje saradnje uvek davala ogromnu dozu pozitivne energije, kao i korisne sugestije i savete za buduća istraživanja.

Takođe, zahvaljujem se svim kolegama i tehničkom osoblju Instituta, koji su mi pružili pomoć u toku eksperimentalnog rada u Institutu, i u industriji mesa.

Ne smem da propustim priliku da se zahvalim svojoj porodici koja je uvek za mene bila, i jeste, tu.

Sve ovo ne bi imalo smisla da nema moje jedinice Milice, koja je moj izvor života i moja zvezda vodilja.

Bakterije mlečne kiseline (BMK) imaju esencijalnu ulogu tokom proizvodnje fermentisanih proizvoda od mesa. Svojom metaboličkom aktivnošću utiču na proces zrenja, dovodeći do stvaranja željenih senzorskih osobina proizvoda, a istovremeno inhibiraju rast neželjenih mikroorganizama. Zbog svoje dominantnosti tokom fermentacije i tradicije duge upotrebe, BMK su označene kao „zdravstveno bezbedna mikroflora“. Biološku zaštitu BMK, kao prirodno prisutna i/ili selekcionisana i namerno dodata mikroflora, ostvaruju kroz produkciju ne specifičnih (mlečna, sirćetna i druge organske kiseline, H20,, diacetil itd) i specifičnih metabolita, bakteriocina.

Bakteriocini su ekstracelularno oslobođeni peptidi ili proteinski molekuli, stvoreni od strane nekih BMK, koji poseduju izvesna baktericidna svojstva u odnosu na određene vrste mikroorganizama, obično srodne bakterijama proizvođačima. Produkcijom bakteriocina, od strane BMK, omogućeno je da se na selektivan, kompetitivan način deluje na okolnu mikrofloru koja može sadržavati bilo bakterije kvara, bilo patogene mikroorganizme.

Danas, bakteriocini, kao prirodni antimikrobni peptidi ili proteini, predstavljaju veoma interesantan potencijal za aplikaciju u industriji hrane, koji deluju u službi očuvanja zdravlja ljudi, uz istovremeni efekat na povećanje njene održivosti.

Visoka stopa mortaliteta, široka rasprostranjenost u sirovim proizvodima, kao i sposobnost preživljavanja u različitim proizvodnim sredinama, predstavljaju velike probleme vezane za Listeria monocytogenes. Stoga su podstaknuti novi principi zaštite, uključujući primenu bakteriocina, u sprečavanju preživljavanja ove bakterije u hrani.

U monografiji su prikazani rezultati dugogodišnjeg istraživanja autora, koja su imala za cilj da se utvrde mogućnosti primene bakteriocin-produkujućih sojeva BMK (Lactobacillus sakei i Leuconostoc mesenteroides) i/ili njihovih bakteriocina u proizvodnji sremske kobasice. Takođe, autor je postupcima precipitacije amonijum sulfatom izolovao sekundarne metabolite, bakteriocine, određivao je njihove osobine, intenzitet i spektar antibakterijskog dejstva, a sve u cilju sagledavanja mogućnosti za njihovu direktnu primenu u industriji mesa. Ispitivanja su obuhvatila određivanje optimalnih uslova za ispoljavanje maksimalne antibakterijske aktivnosti, a vršena su u hranljivim medijumima koji su imitirali uslove proizvodnje sremske kobasice. U cilju dobijanja adekvatne slike o prirodi izolovanih bakteriocina, autor je, pored intenziteta njihove antilisterijske aktivnosti, utvrdio i efekat povišenih i visokih temperatura, kao i njihov odnos prema proteolitičkim enzimima.

Takođe, na bazi dobijenih laboratorijskih rezultata, autor je ispitao antilisterijski efekat izolovanih, i dodatih kao aditiv, bakteriocina prilikom proizvodnje tradicionalne sremske kobasice.

Dr Slavica Vesković

Sadržaj

Predgovor

1. Sažetak

2. Abstract

3. Uvod

3.1. Fermentacija kao način konzervisanja hrane

4. Primena starter kultura u proizvodnji fermentisanih kobasica

4.1. Bakterije familije Micrococcaceae
4.2. Kvasci i plesni
4.3. BMK kao nosioci mlečne fermentacije
4.4. BMK u biološkoj zaštiti hrane

5. Sremska kobasica – nacionalni fermentisani proizvod od mesa

5.1. Mikroflora tradicionalnih fermentisanih kobasica
5.2. Lactobacillus sakei
5.2.1. Lactobacillus sakei – mogučnosti primene u proizvodnji fermentisanih kobasica

6. Bakteriocini BMK kao bioprotektori

6.1. Podela bakteriocina BMK
6.1.1. Lantibiotici – klasa I bakteriocina
6.1.2. Klasa II – peptidni bakteriocini
6.1.3. Klasa III – proteinski bakteriocini
6.1.4. Klasa IV – složeni proteini
6.2. Biosinteza i mehanizam delovanja bakteriocina
6.2.1. Faktori od značaja za aktivnost bakteriocina
6.3. Bakteriocinska svojstva sojeva BMK izolovanih iz fermentisanih kobasica
6.4. Leuconostoc mesenteroides – potencijalni producent bakteriocina
6.5. Postupci izolacije bakteriocina BMK
6.6. Bakteriocini u tehnologiji višestrukih prepreka (HT)
6.7. Jačina aktivnosti bakteriocina BMK poreklom iz fermentisanih kobasica
6.8. Antimikrobni spektar bakteriocina izolovanih iz BMK
6.9. Proteinska priroda bakteriocina BMK
6.10. Uticaj povišenih i visokih temperatura na aktivnost bakteriocina BMK

7. Načini aplikacije bakteriocina u industriji hrane

8. Zaključak

9. Rečnik skraćenica

10. Literatura

11. Indeks pojmova

12. Summarv

3. Uvod

Od davnina ljudi su svesno ili nesvesno tražili načine kako da “konzervišu”, odnosno očuvaju hranu u dužem vremenskom periodu. To je naročito bilo značajno u klimatskim regionima gde se hrana jedino mogla sezonski pribaviti. U takvim uslovima bilo je potrebno namirnice iz vremenski sezonskog ili količinskog “izobilja” sačuvati, tokom čitave godine, za ishranu celokupne porodice ili pak veće zajednice.

Najstariji vidovi konzervisanja hrane su procesi sušenja i fermentacija, čiji su osnovni principi preuzeti iz prirode, a koja ih i danas veoma obilno koristi. Održavanje biljnog sveta bazirano je na sušenju, koje postupcima dehidratacije semena obezbeđuje nastavak života. Sama priroda procesima fermentacije stvara nove proizvode koji, posle dužeg perioda skladištenja, postaju prihvatljivi(ji) za korisnika.

3.1. Fermentacija kao način konzervisanja hrane

Osnove fermentacije, kao načina konzervisanja hrane, danas su preuzeti iz hiljadama godina unazad starih empirijskih saznanja (slika 1). Poznato je da se umetnost izrade sira počela razvijati pre 8000 godina u dolinama reka Tigra i Eufrata u Iraku, što se poklapalo sa početkom domestifikacije životinja i biljaka (Fox, 1993).

Osnove alkoholne fermentacije vezuju se, pak, za period između 2000. i 4000. godine pre nove ere kada su stari narodi, Egipćani i Sumeri, proizvodili napitke nalik današnjem vinu i pivu. Takođe, Egipćani su primenjivali i slučajno otkriveno pozitivno iskustvo u proizvodnji hlebnog testa uz upotrebu “piva” kao kvasca (Koss i sar, 2002).

Industrijska revolucija u oblasti konzervisanja i zaštite hrane ostvarena je onog momenta kada je razjašnjena esencijalna uloga određenih mikroorganizama u samom procesu fermentacije. Hiljadama godina eksploatisan metod čuvanja hrane tek je saznanjima Pastera (1861) mogao da dobije elemente naučne pouzdanosti i ne slučajno izvedene ponovljivosti.

U početku se fermentacija zasnivala isključivo na empirijskom saznanju da se izvesne namimice, posle produženog čuvanja, menjaju u smislu dobijanja novih i boljih senzomih svojstava, ali i značajno veče održivosti u odnosu na sirov materijal.

• Egipćani su otkrili pozitivno svojstvo kvasca u proizvodnjl hleba i vina 4000 p.n.e.
• Proizvodnja sira u Iraku − poklapa se sa domestifikacijom žlvotinja 6000 p.n.e.
• Samarićani − fermentacija piva iz ječma 1750 p.n.e.
• Kina − plesnivi sojini ugrušci upotrebljavani kao antibiotici 500 p.n.e.
• Prva destilacija viskija u Irskoj 1276
• Prva fermentacija jogurta 1500
• Luis Pastera − radovi o buternim bakterijama i kvascima 1861
• Otkrića nizina (najpre nazvan N-inhibitorni protein produktovan od strane laktokoknih bakterija) 1928
• Grupa Ninhibitornih supstanci nazvan-nizin (Mattick & Hirsch) 1947
• Nizin prvi na tržištu Engleske; odobren za upotrebu u drugih 48 zemalja 1953
• FAO/WHO − nizin registrovan kao legalan i dozvoljen aditiv 1969
• FDA − nizin odobren za primenu u industriji hrane kao bioprotektor 1988

Slika 1. Veliki događaji u fermentaciji i prezervaciji hrane

Izostavljeno iz prikaza

Pravac i tok ovih procesa bio je uslovljen aktivnošću slučajno prisutne (“divlje”) mikroflore, koja je često znala da fermentaciji da i neželjeni tok, odnosno da dovede do kvara proizvoda. Kvalitet, na ovaj način dobijenih namirnica, bio je, uglavnom, neujednačen i, često, bez posebno izraženih senzorskih svojstava. Dominantno prisustvo korisnih, homofermentativnih vrsta mikroorganizama doprinosilo je nastanku relativno dobrih proizvoda, u suprotnom, greške u kvalitetu su bile česte.

Danas se na velikom svetskom tržištu hrane i pića nalazi šarolika skala komercijalnih fermentisanih proizvoda u čijoj izradi, ali i obezbeđenju održivosti, učestvuju određeni mikroorganizmi (tabela 1).

Industrija vina, piva i špiritusa, u savremenim uslovima proizvodnje, nezamislive su bez upotrebe određenih kultura kvasaca.

Takođe, danas je dobro poznato da namirnice, čija se proizvodnja u osnovi zasniva na procesima mlečne fennentacije (industrija mleka, mesa, povrća), ne mogu nastati bez esencijanih metaboličkih aktivnosti BMK.

Rezultati ovakvih naučnih saznanja, kao i posledična primena tehnoloških dostignuća iz oblasti fermentacije u industrijskoj proizvodnji, omogučili su da se, danas, 25% ishrane u Evropi i 60% u ostalim razvijenim zemljama sveta zasniva na fermentisanoj hrani (Holzapfel i sar, 1995).