Čovek današnjice je svestan zavisnosti civilizacije od energije. Energija je neophodna za proizvodnju dobara, za transport, zagrevanje, rasvetu i bezbroj drugih potreba.

Energija je neophodna i živim organizmima. U živoj ćeliji se neprekidno proizvode nova jedinjenja, vrši mehanički rad u vidu različitih kretanja, transportuje materija i odaje toplota. Kroz milijarde godina ćelije su stekle sposobnost korišćenja energije daleko efikasnije od svih uređaja koje je do danas čovek stvorio. Žive ćelije mogu poslužiti kao modeli na osnovu kojih, pri kraju ere tosilnih goriva, predstoji stvaranje novih, savršenijih uređaja za korišćenje, pre svega, energije Sunca.

Posebna oblast biohemije, koja se bavi procesima transformacije energije u živim ćelijama je bioenergetika. Nasuprot postojećoj, bogatoj literaturi o strukturi, funkcionisanju i „prekrajanju“ organizama, srazmerno je malo radova o pokretaču stukture i funkcije, o energetici životnih procesa. Kratak pregled osnovnih zakonitosti bioenergetike može poslužiti kao podsetnik svakom ko se bavi primenom nauke u nekoj od oblasti biotehnike i biotehnologije.

Nijedna nauka u istoriji čovečanstva nije više zloupotrebljavana, ideologizirana, mistificirana i više optuživana od nauke o životu. Zato je ova knjiga namenjena i svim zainteresovanim čitaocima, koji su sve više razočarani savremenim dostignućima i zaplašeni kontraverznim tumačenjima napretka u ovoj oblasti prirodnih nauka. Oni u knjizi mogu naći jednu vrstu odgovora na brojna, uvek aktuelna pitanja o životu kao pojavi, steći uvida u ovu nadasve bogatu i neiscrpnu tematiku, odagnati zablude i dobiti podsticaja vraćanju poverenja u prirodne nauke kao zaloge dobrobiti.

Osnovni principi energetike organizma najlakše se uočavaju na najjednostavnijim oblicima života, na mikroorganizmima. Kao plod višegodišnjeg rada autora u oblasti mikrobioloških procesa, ova publikacija teži da bude udžbenik i da istovremeno približi tematiku širokom krugu čitalaca. U naučnoj oblasti koja je doživela izuzetnu ekspanziju saznanja drugom polovinom dvadesetog veka, ostvarenje cilja autor pokušava da postigne izbegavanjem mnoštva podataka i detalja u knjizi, rizikujući subjektivnost pri izboru i uopštavanju činjenica. Rizik je i da se pri usaglašavanju dve namene knjige, linija nužnog kompromisa uspostavi na uštrb stručnosti. Konačno, rizik je i u opšte poznatoj činjenici da višenamenske stvari najčešće, ne odgovaraju ni jednoj. Mogući, makar i delimičan uspeh u ispunjenju dvojake namene knjige, bio je jak izazov i osnovni motiv autoru za svesno prihvatanje rizika.

Autor
Dr Jožef Božo

Sadržaj

OTVORENI SISTEM – ORGANIZAM

TERMODINAMIKA ORGANIZMA – ĆELIJE

I zakon termodinamike Entalpija
II zakon termodinamike Entropija
Slobodna energija
Entropija i entalpija hemijskih reakcija
Otvoreni sistem – organizam

HEMIJSKA ENERGIJA

Slabe hemijske veze
Van der Waals-ove veze
Vodonična, H-veza
Jonske veze
Vodeni rastvori

ELEMENTI SISTEMA (ORGANIZMA)

Atomi i molekuli
Atomi
Mali molekuli ugljenih hidrata (šećeri)
Aminokiseline
Nukleotidi
Lipidi
Makromolekuli
Polisaharidi
Proteini
Enzimi – biokatalizatori i energija aktivacije
Nukleinske kiseline – DNK, RNK
Informaciona RNK (iRNK)
Ribozomalna RNK (rRNK)
Transportna RNK (tRNK)

ADENOZINTRIFOSFAT (ATP)

OPŠTA SVOJSTVA ENERGETSKIH PROCESA ORGANIZMA

Izvori energije
Univerzalne forme energije – ATP i TGP
Potrošnja energije u ćeliji
Energetske zalihe u ćcliji

ORGANIZAM I METABOLIZAM

REGULACIJA METABOLIZMA PROKARIOTA

Regulacija aktivnosti enzima
Regulacija sinteze enzima
Represija finalnim proizvodom
Indukcija sinteze enzima Katabolitna represija

GENETIKA I EVOLUCIJA

Mutacijc Rekombinacije

POSTANJE I EVOLUCIJA ENERGETSKIH PROCESA

POSTANAK SISTEMA – PREDBIOLOŠKA EVOLUCIJA

Hemijska evolucija Evolucija strukture

MEHANIZAM SUPSTRATNE FOSFORILACIJE – VRENJE (FERMENTACIJA)

Procesi vrenja zasnovani na glikolizi Homofermentativno mlečnokiselinsko vrenje
Alkoholno vrenje
Alkoholna fermentacija kod prokariota
Alkoholna fermentacija kod eukariota
Propionsko vrenje
Buternokiselinsko vrenje
Alternativni putevi fermentacije ugljenih hidrata
Oksidativni pentozofosfatni put
Put Entner – Dudorof

MEHANIZAM FOTOFOSFORILACIJE

Pigmenti fotosintetskih prokariota
Hlorofili
Fikobiliproteidi
Karotinoidi
Apsorpcioni spektri fotosintetskih prokariota
Strukturna organizacija fotosintetskog aparata prokariota
Fizičke osnove fotosinteze
Fotohemijski procesi, transport elektrona i fotofosforilacija
Stvaranje reducenata u fotosintezi
Priroda egzogenih donora elektrona u fotosintezi bez oslobađanja kiseonika
Nastanak drugog fotosistema (FS II)
Putevi korišćenja C02 – pojava autotrofije
Asimilacija C02 kod zelenih sulfobakterija – Arnonov ciklus
Kalvinov ciklus – osnovni put fiksacije C02 fotosintetskih organizama
Fotosinteza bez hlorofila – III tip fotosintezc

MOLEKULSKI KISEONIK KAO FAKTOR EVOLUCIJE

Interakcija prokariotskog organizma i 02
Toksični efekti 02 i njegovih radikala
Molekulski kiseonik, 02
Superoksidni anjon
Hidroksidni radikal
Vodonikperoksid
Singletni kiseonik
Ozon i atomski kiseonik
Zaštitni mehanizmi ćelije
Enzimski zaštini sistemi
Mehanizmi zaštite pomoću metabolita Adaptacije prokariota kao mehanizmi zaštite od kiseonika
Molekulski kiseonik u metabolizmu prokariota
Formiranje mehanizma oksidacije koji omogućava dobijanje korisne energije za organizam
1. Nastanak reverzibilne protonzavisne ATP-sintetaze
2. Rastvorni sistemi transporta elektrona na 02 kod primarnih anaeroba
2 Formiranje puteva prenosa elektrona vezanih za membranu u anaerobnim uslovima ŽIVOT ZASNOVAN NA

OKSIDATIVNOJ FOSFORILACIJI – DISANJU

Ciklus trikarbonskih kiselina
Lanac disanja.
Prenos elektrona po respiratornom lancu
Akumulacija energije u procesu disanja
– oksidativna fosforilacija Anaerobno disanje
Transformacija hemijske energije u svetlosnu
– pojava bioluminescencije Hemolitotrofija Hemoorganotrofija

1. Opšta svojstva energetskih procesa organizma

1.5. Opšta svojstva energetskih procesa organizma

1.5.1. Izvori energije. Osnovni zakoni termodinamike onemogućavaju organizmima korišćenje toplotne energije za životne procese. Nedostupna im je nuklearna i mehanička energija. Energetski resursi živih sistema su fizičke i hemijske prirode:

– fizička energija elektromagnetnih talasa (svetlost određenih talasnih dužina);
– hemijska energija redukovanih jedinjenja.

Najčešći energetski izvori živih sistema su biopolimeri iz okruženja (hrana): lipidi, polisaharidi, proteini i nukleinske kiseline. Pre korišćenja u energetske svrhe, biopolimeri moraju biti hidrolizovani do sastavnih elemenata, monomera. Hidroliza u primarnom metabolizmu omogućava da se ogroman broj mogućih, različitih polipeptida i polinukleotida iz hrane svede na svega dvadesetak aminokiselina i pet mononukleotida. Primarni metabolizam ima zadatak da redukuje izbor molekula za dalje procese metabolizma. Polimeri ne mogu prodreti kroz membranu citoplazme, njihovu vanćelijsku hidrolizu obavljaju enzimi, koji se sintetišu u ćeliji i izlučuju u spoljašnju sredinu − egzoenzimi. Amilaze razlažu skrob i glikogen, dok celulaze razlažu glikozidne veze celuloze. Pojedine bakterije stvaraju pektinazu, hitinazu, agarazu i druge enzime, koji hidrolizuju odgovarajuće polisaharide. Proteine razlažu ekstracelularne proteaze, koje deluju na peptidne veze. Nukleinske kiseline hidrolizuju ribo-, i dezoksiribonukleaze. Stvoreni manji molekuli monomera lako se transportuju kroz membranu u ćeliju. Ekstracelularnom razgradnjom biopolimera ne stvara se slobodna energija, koja bi bila dostupna ćeliji, a ni rasejavanje energije u tim procesima nije značajno.

Za razliku od ekstracelularnih procesa, razgradnja masnih kiselina odvija se u više faza u ćeliji pošto obezbeđuje značajne količine energije. U prvoj fazi masne kiseline se transformišu odgovarajućim enzimima u CoA-proizvode, koji bivaju podvrgnuti [3oksidacijama, uz izdvajanje acetil-CoA. Acetil-CoA se koristi za dobijanje energije u metaboličkom aparatu. Drugi proizvod reakcije, CoA-ostatak masne kiseline, skraćene za dva ugljenikova atoma, podvrgava se daljim p-oksidacijama (C2 skraćivanjima), uz dobijanje energije za ćeliju u vidu energijom bogatih molekula acetil-CoA.

Prozvodi primarnog metabolizma, monomeri, podvrgavaju se daljim enzimskim reakcijama strukturnog i energetskog metabolizma mogu poslužiti kao elementi za sintezu ćelijskih sastojaka ili se razgrađuju u procesu dobijanja energije. Postoji više puteva njihove dalje razgradnje: Embden-Majerhof put, Entner-Dudorof put, Krebsov ciklus i dr. Za razliku od oksidacije, koja se odvija van živog sistema, zajednička odlika svih kataboličkih puteva je postupnost procesa oksidacije polaznog supstrata. Na više mesta oksidacija supstrata u ćeliji povezana je sa stvaranjem energije u formi koja obezbeđuje njenu primenu u najrazličitije svrhe (slika 22).

• Postepena oksidacija šećera u ćeliji
• Sagorevanje šećera
• Šećer + 02.
• male količine aktivacione energije
• poreklom od telesne
  temperature,
• dovoljne zbog prisustva
• efikasnih katalizatora − enzima
• Šećer + O2
• velika aktivaciona energija poreklom od temperature vatre
• CO2 + H2O
• akumulirana energija u aktiviranim molekulima, prenosnicima energije
• nema transformacije, akumulacije energije, sva slobodna energija u vidu toplote
• CO2 + H2O

Slika 22. Oksidacija šećera u ćeliji i sagorevanje šećera

Slika 22. Oksidacija šećera u ćeliji i sagorevanje šećera

Izostavljeno iz prikaza

Svi izvori energije dostupni organizmu (svetlost, hemijska jedinjenja) moraju biti transformisani u formu koja će odgovarati potrebama ćelije.

Opšti oblik procesa oksidacije, izvora energije u ćeliji:

A → B + e

može se predstaviti sa tri primera:

1. Fe2+ → Fe1+ + e
2. -CH2-CH2→-CH = CH-+2H + + 2e
3. CH. + 1/2 O2 → CH ,OH

U prvoj reakciji, oksidacija jona dvovalentnog gvožđa je gubitak elektrona. U drugom primeru, oksidacija ugljovodoničnog supstrata se može smatrati odvajanjem vodonika (H2) (dehidrogenacijom) ili nezavisnim odvajanjem dva protona (H4) i dva elektrona (e). Po pravilu, u biohemijskim procesima prenos vodonika se ostvaruje odvojenim transportom protona i elektrona. Protoni se čak izdvajaju u spoljašnju sredinu, odakle se uzimaju kada se ukaže potreba. Elektroni se neposredno predaju odgovarajućim molekulima unutar ćelije. Sve oksido-redukujuće reakcije predstavljaju prenos elektrona.

Treći primer ilustruje pripajanje atoma kiseonika molekulu supstrata. Oksido-redukujući karakter reakcije nije toliko očigledan kao u prethodna dva primera, ne dolazi do otcepljenja elektrona od molekula supstrata (metana). U ovom slučaju rezultat oksidacije je promena veze C-H u C-OH, pri čemu pripojeni kiseonik odvlači elektrone od atoma ugljenika, tj. ugljenik biva oksidovan, dok se kiseonik redukuje. Unutar molekula dolazi do preraspodele elektronskog para između atoma C i O, do intramolekulske redoks transformacije.

Reakcije u kojima dolazi do odvajanja elektrona, mogu biti izvori energije. Jedinjenja sposobna da se oksiduju, da budu izvori elektrona, koji se od njih odvajaju, su donori elektrona. Pošto elektroni ne mogu opstati samostalno poput protona, moraju biti preneti na molekule, koji su u stanju da ih prime i da se redukuju. To su akceptori elektrona. Donor elektrona ne može biti već oksidovani supstrat, kao što ni akceptor ne može biti redukovana supstanca. Zato je neophodna stalna razmena materije organizma sa okolinom, priliv energenata i eliminacija proizvoda oksidacije. Organizam postepeno crpi energiju iz hranljivog supstrata u malim dozama, u nizu uzastopnih reakcija oksidacije, koje obavlja enzimski sistem metabolizma (slika 22).

Već kod najjednostavnijih organizama, prokariota, mogu se naći sva tri mehanizma dobijanja (transformacije) energije u živom svetu:vrenje, fotosinteza i disanje.

U procesima vrenja, kao rezultat redoks reakcija, stvaraju se nestabilni molekuli sa fosfatnim grupama, bogati slobodnom energijom. Fosfatnu grupu odgovarajući enzim dalje prenosi na molekul adenozin difosfata (ADP) i stvara se adenozin trifosfat (ATP) − slika 23. Reakcije u kojima se energija, dobijena u oksidativnim procesima vrenja, skladišti u molekule ATP, nazivaju se reakcijama supstratne fosforilacije (substrate level phosphorylation). Ove reakcije obavljaju slobodni enzimi u rastvoru. Reakcije supstratne fosforilacije nisu vezane za membranske strukture. U toku oksido-redukujuće reakcije, stvorena redukovana supstanca (redukovani nikotinamid dinukleotid (NADH2), redukovani nikotinamid dinukleotid fosfat (NADPH2) − slika 24, redukovani feredoksin) prenosi elektrone na sledeći endogeni akceptor elektrona (piruvat, acetaldehid, aceton i dr.) ili ih oslobađa u vidu gasovitog vodonika, H2. Na slici 25 prikazan je model procesa fermentacije (supstratne fosforilacije).

• slobodna
• energija
• korisna
• za ćelijski
• rad, hemijsku
• sintezu
• energija hrane, svetlosti
• ATP
• ADP

Slika 23.Interkonverzija ATP-ADP

Izostavljeno iz prikaza

Brojni organizmi dobijaju energiju disanjem (respiracijom). Oni oksiduju redukovane molekule sa relativno niskim redoks potencijalom (Eo) iz supstrata ili intermedijarnog metabolizma (NADH2, sukcinat, laktat, NH3, H2S i dr.). U tabeli 7 data je vrednost redoks potencijala pojedinih učesnika energetskog metabolizma prokariota.

Redoks potencijal predstavlja sposobnost supstanci da budu donori ili akceptori elektrona. Vrednost redoks potencijala se može eksperimentalno odrediti za svaki oksido-redukujući sistem. Izmerene vrednosti se mogu uporediti sa redoks potencijalom reakcije:

H2 ↔ 2/7+ +2e

Standardni redoks potencijal (Eo pri pH 7) ove reakcije je -420 mV. Visoka negativna vrednost standardnog redoks potencijala vodonika govori o njegovoj izraženoj sposobnosti redukcije, odavanja elektrona. Standardni redoks potencijal sistema

H2O ↔ O2 + 2H+ + 2e

je +820 mV. Velika pozitivna vrednost označava da voda teško odaje elektrone, da je molekulski kiseonik snažan akceptor elektrona.

Slika 24. Struktura NAD i NADP

Izostavljeno iz prikaza

• supstrat
• glukoza
• ADP+P
• ATP
• NAD ↔ 2NAD
• 2ADP+2P
• NADH2 2ATp — 2NADH2
• oksidovani
• intermedijer
• 2 piruvat
• NADH2 → NAD
• redukovani finalni proizvod
• 2NADH2 — 2NAD
• laktat

Slika 25. Model fermentacije (supstratne fosforilacije)

Izostavljeno iz prikaza

• Nikotinamid
• NAD
• NADH +2e +2H+
• Redukcija
• Oksidacija
• Dodatni fosfat u NADP

Tabela 7. Standardni redoks potencijal (Eo)

Izostavljeno iz prikaza

• Oksido-redukujući sistem mV
• piruvat/acetat + CO2 -700
• a-keto-glutarat/ sukcinat + CO2 -670
• acetat/acetaldehid -600
• CO2/formiat -432
• H71/2 H2 -420
• feredoksin oks./red. (Cl. pasterianum) -420
• NAD(P)7NAD(P)H2 -320
• S/HS’ -270
• CO2/CH4 -244
• SO427HS -220
• fad/fadh2 -220
• Oksido-redukujući sistem mV
• fmn/fmnh2 -190
• rubredoksin oks./red. -57
• fumarat/sukcinat +30
• citohrom b oks./red. +70
• ubihinon oks./red. + 100
• citohrom b2 oks./red. +120
• citohrom c oks./red. +220
• citohrom a oks./red. +290
• NO37NO2‘ +433
• Fea7Fe2+ +772
• 1/2O2/H2O +820

Na osnovu vrednosti redoks potencijala, u lancu oksido-redukujućih reakcija elektroni se premeštaju od elektronegativnijih ka elektropozitivnijim sistemima bez uzimanja energije iz spoljašnjosti, oslobađanjem energije redoks potencijala.

U toku procesa disanja oksidacija se odvija preko sistema za transport eiektrona (electron transport systerri), koji je vezan za membranu. Lanac transporta elektrona se sastoji od niza prenosnika i u najvećem broju slučajeva obavlja redukciju molekularnog kiseonika, egzogenog O2, jakog oksidujućeg agensa sa visokim pozitivnim redoks potencijalom, do H2O. U živom svetu najzastupljenija je sposobnost dobijanja energije oksidacijom organskih supstrata. Postoje grupe prokariota sposobne da oksiduju i različita neorganska jedinjenja (H2, NH4+, NO2-, H2S, S2O32 , Fe2+ i dr.), uz odgovarajuću redukciju O2. Određeni prokarioti mogu vršiti oksidaciju organskih i neorganskih supstrata a da kao krajnji akceptor elektrona koriste ne kiseonik, već niz drugih organskih i neorganskih jedinjenja (fumarat, CO2, NO3 , SO42-, SO32- i dr.). Pri tome, količinu oslobođene energije određuje gradijent redoks potencijala između donora i akceptora elektrona. Na primer, oksidacija H2 molekulskim kiseonikom daje mnogo više slobodne energije (AG0 = -238 KJ/mol) nego oksidacija NADH2 fumaratom (AG0 = − 68 KJ/mol).

Za dobijanje energije iz svetlosti kod prokariota postoje tri tipa procesa fotosinteze:

• I. bakteriohlorofilna, bez produkcije kiseonika (zelene, purpurne bakterije);
• II. bakteriohlorofilna, uz produkciju kiseonika (grupe cijanobakterija, Prochlorales)’,
• III. bakteriorodopsinska, bez produkcije kiseonika (grupe halofilnih bakterija).

Fotosinteze I i II tipa se odvijaju uz učešće pigmenata, receptora svetlosti. Primljena energija dovodi do polarizacije naboja, odnosno, do stvaranja gradijenta potencijala između reducenta sa niskim i oksidansa sa visokim redoks potencijalom. Prenos elektrona, koji sledi između nastalih komponenti i pražnjenje gradijenta, omogućava dobijanje slobodne energije. U fotosintezi tipa III, takođe, postoji receptor svetlosti ali nema redoks transmitera. Energija u formi, koja je dostupna organizmu, nastaje kao rezultat svetlosno zavisnog transporta H* kroz membranu.

Izučavanje transportnih lanaca elektrona u procesima disanja i fotosinteze I i II ukazalo je na principijelnu sličnost ovih procesa. Pri disanju, kao i pri fotosintezi I i II, transport elektrona se odvija preko prenosilaca − flavoproteida, hinona, citohroma i proteina, koji sadrže nehemsko gvožđe. Transport elektrona se uvek odvija u pravcu koji određuje termodinamička lestvica transmitera, transportni lanci su uvek oksidujući. Razlike između disanja i fotosinteze uočavaju se tek pri detaljnijem izučavanju sistema − po izboru donora i akceptora elektrona u konkretnoj organizaciji lanaca transporta elektrona, po strukturi prenosnika, njihovom položaju i dr. U procesima disanja i fotosinteze, energija oslobođena pri prenosu elektrona transformiše se prvenstveno u elektrohemijsku energiju transmembranskog gradijenta jona vodonika (protona). Hemijska i elektromagnetna energija izvora prevodi se u elektrohemijsku energiju. Ova energija može biti korišćena i za sintezu ATP. Za razliku od supstratne fosforilacije pri vrenju, ovde su enzimi, koji vrše sintezu ATP, vezani za membrane (membrane-bound ATPase), te su reakcije, koje dovode do stvaranja ATP, reakcije membranske fosforilacije (electron transport phosphorylation). Dok se supstratna fosforilacija odvija u rastvoru i in vitro, membranska fosforilacija je uslovljena postojanjem odgovarajućih strukturnih elemenata, „opreme“ − membrana, sistema za transport elektrona, strukturno vezanih enzima i dr. Mogla je nastati tek na određenom nivou evolutivnog razvoja, struktume diferenciranosti. Prema poreklu energije za sintezu ATP, reakcije membranske fosforilacije mogu biti oksidativne ili fotosintetičke.

Energija dobijena u procesu vrenja, disanja i fotosinteze transformiše se u ćeliji u istu formu.

1.5.2. Univerzalne forme energije − ATP i TGP. Postoje dve univerzalne forme energije, koje mogu biti primenjene za sve energetske potrebe ćelije:

1. hemijska energija visokoenergetskih jedinjenja (ATP);
2. elektrohemijska energija transmembranskog gradijenta protona − TGP (proton motive force, PMF).

Postoji više vrsta različitih hemijskih jedinjenja bogatih energijom. Najveću grupu čine jedinjenja sa visokoenergetskom fosfatnom vezom (tabela 6). Sva ova jedinjenja unutar molekula sadrže grupu sa visokim energetskim potencijalom. Pri prenosu ove grupe, kidanjem njene veze sa ostatkom molekula, dolazi do drastičnog pada slobodne energije sadržane u molekulu. Takva veza je visokoenergetska ili makroergična. Spajanje grupe sa visokim energetskim potencijalom i molekula-akceptora povećava nivo slobodne energije u njemu, dovodi molekul akceptora u aktiviranu formu u kojoj raspolaže energijom (aktivacionom energijom) za stupanje u reakcije biosinteze.

U sintezi proteina učestvuje guanozin-trifosfat (GTP). U jednoj etapi sinteze peptoglikana ćelijskog zida prokariota koristi se uridin-trifosfat (UTP). Aktivacija kiselinskih ostataka radi biosinteze viših masnih kiselina odvija se stvaranjem acil-CoA-proizvoda sa visokoenergetskom tioestarskom vezom. Navedena jedinjenja sa makroergičnom vezom učestvuju u ograničenom broju procesa biosinteze.

Centralno mesto u prenosu hemijske energije zauzima ATP. ATP se stvara u reakcijama supstratne i membranske fosforilacije. Pri supstratnoj fosforilaciji stvaranje ATP se odvija na osnovu dva tipa reakcija:

I. supstrat~P + ADP ↔ supstrat + ATP
II. supstrat~X + ADP + Pj ↔ supstrat + X + ATP

Simbol ~ označava makroergičnu vezu, P; − inorganski fosfat

U reakcijama prvog tipa dolazi do prenosa visokoenergetske fosfatne grupe sa molekula donora na ADP, koji kataliziraju odgovarajući enzimi, kinaze. Ovom tipu pripadaju, na primer, reakcije supstratne fosforilacije, pri anaerobnoj transformaciji šećera. Drugi tip supstratne fosforilacije može se naći u organizmima u kojima se odvija ciklus trikarbonskih kiselina − u toku reakcije transformacije sukcinil-CoA u ćilibarnu kiselinu energija se zahvata u fosfatnoj grupi GTP, koja se prosleđuje na ADP (slika 77).

ATP se može stvoriti i na račun energije transmembranskog gradijenta protona u procesu membranske fosforilacije.

Već je istaknuto, da je molekul ATP, pri pH 7,0 visokonaelektrisani anjon, da sadrži četiri OH grupe sposobne da se jonizuju (slika 20). Poznato je i da je u ćeliji mali broj molekula ATP u vidu slobodnih anjona, pretežno stvaraju komplekse sa jonima magnezijuma i mangana (MgATP2, MnATP2 ) − slika 21. Molekul ATP sadrži dve makroergične fosfatne veze. Hidrolizom ovih veza oslobađa se značajna količina energije:

ATP + H2O => ADP + P, AG0 =-31,8 KJ/mol
ADP + H2O =>AMP + P| AGO =-25,1 KJ/mol

Odvajanjem poslednje fosfatne grupe od molekula AMP oslobađa se daleko manje energije:

AMP + H2O => adenozin + P, AG0 = -14,3 KJ/mol

Molekul ATP raspolaže svojstvima koja su bila od velikog značaja u evoluciji energetskog metabolizma. Molekul ATP je termodinamički nestabilan, na šta ukazuje velika negativna vrednost AG pri hidrolizi. Uprkos tome, brzina neenzimske hidrolize ATP u normalnim uslovima je veoma mala, tj. molekul ATP je hemijski veoma stabilan. Ova stabilnost obezbeđuje efikasno održanje energije u molekulu ATP, sprečava njeno nekorisno odavanje u obliku toplote. Male dimenzije molekula ATP omogućavaju laku difuziju u sve delove ćelije, gde je neophodan izvor energije za obavljanje hemijskog, osmotskog ili mehaničkog rada. Upoređivanjem slobodne energije hidrolize fosforilisanih jedinjenja može se uspostaviti određeni niz. Na jednom kraju niza nalaziće se jedinjenja sa visokom oslobođenom energijom pri hidrolizi, na primer, fosfoenolpiruvat (AG0 = -50,2 KJ/mol), a na drugom kraju − niskoenergetska jedinjenja, na primer, glicero-1-fosfat (AG0 = -9,2 KJ/mol). ATP na ovoj lestvici zauzima srednji položaj (AG0 = -31,8 KJ/mol), što mu omogućava ulogu posrednika (medijatora), pri obavljanju osnovne energetske funkcije, prenosa energije sa visokoenergetskih na niskoenergetska jedinjenja. Količina energije sadržana u makroergičnoj fosfatnoj vezi ATP odgovara najvećem broju energetskih potreba ćelije. To čini organizam izuzetno racionalnim, visokoefektivnim energetskim mehanizmom.

Korišćenje energetskih resursa (organskih i neorganskih jedinjenja, pri disanju i svetlosti, pri fotosintezi) vezano je za transport elektrona po lancu prenosnika, koji se sastoji, kao što je već rečeno, od proteinskih i neproteinskih elemenata, sposobnih za reverzibilnu oksidaciju-redukciju. Pri disanju i fotosintezi u toku transporta elektrona, na određenim mestima transportnog lanca, energija se transformira u hemijsku energiju fosfatnih veza ATP.

Molekularni mehanizam, koji povezuje procese transporta eiektrona i fosforilacije, dugo je bio nepoznat. Mičel (Mitchell P., 1979.) je hemiosmotskom teorijom definisao mehanizam transformacije energije, koja se oslobađa pri transportu elektrona u energiju fosfatne veze ATP. Na određenim mestima (coupling sites), pri prenosu elektrona po oksidativnom lancu, lokalizovanom u odgovarajućim membranama, dolazi do neravnomerne raspodele H’ sa spoIjašnje i unutrašnje strane membrane (slika 26).

Slika 26. Model petlje prenosa elektrona i protona po transportnom lancu i protona preko protonzavisne ATP-sintetaze u membrani (AH2 i B − donor i akceptor elektrona; 1,2,3 − komponente transportnog lanca elektrona)

Izostavljeno iz prikaza

Po predloženom modelu prenosnici elektrona imaju određeni raspored po spoljašnjoj, unutrašnjoj površini i u dubini membrane (na primer, citoplazmatične membrane, CPM). Njihov raspored omogućava stvaranje petlji (loops) u lancu prenosa elektrona. U svakoj petlji se dva atoma vodonika (2H++2e) prebacuju sa unutrašnje strane CPM na spoljašnju, pomoću prenosilaca vodonika (hinona, QH2). Nakon toga, dva elektrona (2e) se vraćaju na unutrašnju stranu membrane odgovarajućim prenosnikom elektrona (citohromi, b→b→o), dok se nastala dva protona (2H+) oslobađaju u spoljašnju sredinu. Svaka oksido-redukujuća petlja izbacuje po dva protona iz citoplazme u spoljašnju sredinu. U CPM može postojati veći broj petlji. Pri radu bilo kog membranskog lanca za transport elektrona, pri disanju ili fotosintezi, u spoljašnjoj sredini se nagomilavaju joni vodonika (protoni, H+). To dovodi do zakišeljavanja (pH<7) spoljašnje sredine, dok citoplazma postaje baznija (pH>7). Nastaje razlika u količini jona vodonika sa dve strane membrane.

• Spoljašnja sredina
  CPM
  Citoplazma
  ATP sintetaza
  ATP + 2H+ + ADP + Pi

Pošto su H+ čestice, koje nose naelektrisanje, nejednaka količina naelektrisanja sa dve strane membrane dovodi do nastanka ne samo hemijskog (koncentracionog) gradijenta vodonikovih jona (ApH), već i gradijenta potencijala (AM^), električnog polja između sumarnog pozitivnog naboja spolja i negativnog naboja u ćeliji. Pri prenosu elektrona po CPM nastaje transmembranski elektrohemijski gradijent protona (TGP ili ApH+), koji je dvojake prirode: hemijske (razlika u koncentraciji H+, ApH) i električne (razlika potencijala sa dve strane mebrane, AM< merljivi napon u V ili mV), gde je

ApH+ = AT − Z ΔpH

(Z je koeficijent za prevođenje jedinica pH u mV)

Merenja su pokazala da pri fotosintezi i disanju prokariota transmembranski gradijent protona dostiže 230-290 mV.

Po hemiosmotskoj teoriji, energija koja se oslobađa pri transportu elektrona, bez obzira na poreklo, biva sačuvana u formi transmembranskog gradijenta protona. Pražnjenje napona, tj. potrošnju energije omogućava ATP-sintetaza prisutna u membrani (membrane-bound ATPsynthetase). H+ se vraća po gradijentu preko H’zavisne ATPsintetaze, pri čemu iz ADP i neorganskog fosfata nastaje ATP (slika 26). Za sintezu jednog molekula ATP dovoljan je prenos dva protona. Enzimski kompleks H+-zavisne ATPsintetaze, lokalizovan u membrani, katalizira reakciju sinteze i hidrolize ATP po jednačini:

Izostavljeno iz prikaza

Reakcija s leva na desno označava transport H+ po gradijentu i dovodi do pada gradijenta (pražnjenja napona, izjednačavanja koncentracije) i sinteze energetski bogatog molekula ATP. Reakcija u suprotnom pravcu, hidroliza ATP, oslobađa energiju, koja omogućava prenos H+ uz gradijent i dovodi do stvaranja napona na membrani. ATP-azni enzimski kompleks u membrani predstavlja mehanizam uzajamne transformacije (konverzije) dve forme energije:

TGP ↔ ATP

a time i mehanizam povezivanja procesa oksidacije i fosforilacije u jedinstveni proces oksidativne fosforilacije.

Energija u obliku elektrohemijskog gradijenta protona može se koristiti u različitim energozavisnim procesima, koji su lokalizovani na membrani. Sinteza ATP, na račun energije TGP, može se smatrati hemijskim radom. Na račun energije TGP ostvaruje se i sinteza neorganskog pirofosfata (katalizirana enzimskim kompleksom u membrani), povratni prenos elektrona za redukciju NAD(P)+, fiksacija molekulskog azota, kao i pojedini genetski procesi. Pokretljivost mnogih prokariota se obezbeđuje snabdevanjem motornog aparata (slika 27) na račun energije TGP.

Slika 27. Šematski presek citoplazmatične membrane E. coli (Todar K., 2004.)

Izostavljeno iz prikaza

• laktoza
• motorni aparat
• NADH+H*
• NAD
• ATP
• ADP+Pi
• prolin

Važna je uloga energije TGP u aktivnom transportu molekula i jona kroz CPM. Kod prokariota postoje dva tipa transportnih sistema: primarni i sekundarni transportni sistem.

U primarni transportni sistem mogu se svrstati prenosi protona:

a. pomoću oksido-redukujuće petlje (petlje u lancu prenosa elektrona);
b. kao rezultat hidrolize ATP (aktivnosću H+-ATPsintetaze);
c. pomoću bakteriorodopsina,

koji se ostvaruju na račun hemijske energije (a, b) ili elektromagnetne energije svetlosti (a, b, c). Rezultat funkcionisanja primarnog transportnog sistema je generisanje energije na membrani u formi TGP, koja može služiti i kao pokretačka sila za „uzimanje“ supstrata iz spoljašnje sredine, kao i za izlučivanje proizvoda metabolizma.

U sekundarnom transportnom sistemu ostvaruje se utrošak energije TGP, vrši se transmembranski prenos supstanci po gradijentu TGP (potencijala, A’4J i/ili koncentracije, ApH). Pasivna difuzija supstanci kroz membranu odvija se pri propustljivosti membrane niz gradijent potencijala/koncentracije sa dve strane membrane. U slučaju nepropustljivosti membrane i/ili nasuprot gradijentu potencijala/koncentracije neophodan je aktivan transport, uz utrošak energije. Mehanizmi sekundarnog transportnog sistema mogu biti:

a. uniportni (prenos čestica koji nije vezan za transport ničeg drugog, ni u jednom pravcu);
b. simportni (transport molekula vezan za prenos protona u istom pravcu preko istog proteina (sistema proteina) prenosnika (carrier-a), na primer, simporti laktoze i prolina) − slika 27;
c. antiportni (transport molekula u sprezi sa prenosom protona u suprotnom pravcu, na primer, antiporti Ca2′ i Na’) − slika 27.

Uniportnim i simportnim transportom se odvija najveći deo snabdevanja prokariotske ćelije organskim i neorganskim jedinjenjima. Za aktivan transport molekula od značaja je zbirno elektronegativno naelektrisanje citoplazme. Neutralni molekuli, na primer, glukoza, galaktoza i neutralne aminokiseline prenose se u ćeliju simportno sa protonima, na račun obe komponente TGP : A^P i ApH. Elektronegativni molekuli simportuju se sa H’ u elektroneutralnom paru, samo na račun ApH. Elektropozitivni molekuli i neorganski joni (na primer, lizin, K’ i dr.) se prenose u citoplazmu mehanizmom uniporta na račun A’+’. Primer antiporta je izbacivanje jona Na’ i Ca2i iz citoplazme u zamenu za H+ na račun ApH.

• svetlost
• org., neorg. suostrati
• transportni sistem elektrona
• organski supstrati
• supstratna fosforilacija

Slika 28. Transformacije energije kod prokariota

Izostavljeno iz prikaza

Slikovito, ATP i TGP su dve „konvertibilne energetske monete“ ćelije, svaka može biti korišćena za obavljanje hemijskog, osmotskog i mehaničkog rada.Transformacije energije kod prokariota prikazane su na slici 28. Može se postaviti pitanje: zbog čega su ćeliji potrebne dve forme energije?

ATP učestvuje u reakcijama koje se odvijaju u citoplazmi, obezbeđuje energiju za većinu biohemijskih reakcija. Pored toga, ATP služi kao izvor energije i za niz procesa vezanih za membrane. Energija protonskog gradijenta vezana je za membrane gde i nastaje. Ova forma energije, obezbeđujući prevashodno procese lokalizovane na membrani, ima užu primenu. Ipak, energija u obliku TGP pruža i pogodnosti. Pri korišćenju TGP za membranske procese nema potrebe za transformacijom energije, nema ni gubitaka pri transformaciji. Brzina prenosa energije, difuzijom ATP, znatno je manja od brzine prenosa električne energije (A’+’) po membrani. Difuzija ATP može biti veoma otežana u ćelijama sa razvijenim sistemom membrana u citoplazmi. Prenos energije difuzijom ATP je pogotovo neefikasan u međućelijskom transportu energije kod višećelijskih organizama. Energija TGP se ne nalazi u određenim količinama („kvantno“), kao što je to slučaj sa ATP (AG0 = -31,8 KJ/mol).

• ATP
• TGP
• svetljenje (bioluminescencija)
• hemijski rad (biosinteze)
• hemijski rad (sinteza ATP, pirofosfata, reversni transfer elektrona)
• membranska
• fosforilacija
• Hidroliza ATP
• (H’-ATPaza)
• stvaranje toplote osmotski rad (aktivni transport)
• mehanički rad (kretanje)

Ukoliko je za neki endergonični proces potrebno manje energije od doze u ATP, višak se gubi u obliku toplote. Pri korišćenju energije TGP takvih gubitaka nema. Kontinualni karakter TGP znači istovremeno i da ne postoji donji prag stvaranja. Za sintezu ATP neophodna je minimalna razlika redoks potencijala od 200 mV. Ispod ovog praga ATP se ne može sintetisati. Energija TGP se može stvoriti i koristiti u ćeliji i u uslovima u kojima je sinteza i primena ATP nemoguća.

Obe forme ćelijske energije se mogu koristiti za vršenje hemijskog, mehaničkog i osmotskog rada (slika 28), ali ipak postoji određena „podela posla“. Većina procesa biosinteze obezbeđuje se energijom iz ATP dok aktivni transport koristi TGP. Oba pula (pool) energije su neophodna za funkcionisanje životnih procesa i mada pojedinačno nisu veliki, brzo prelivanje energije između njih, čini ih veoma efikasnim.

1.5.3. Potrošnja energije u ćeliji. Energija u ćeliji se koristi u mnoge svrhe. Kultura u rastu troši energiju na biosintezu ćelijskih sastojaka. Količina potrebne energije za biosintezu zavisi od sastava hranljive podloge. Prema opštem modelu, bakterijska kultura na mineralnoj podlozi sa glukozom, kao jedinim izvorom ugljenika, troši oko 1 mol ATP za sintezu 27 g ćelijske biomase. Ukoliko se kao jedini izvor ugljenika primeni CO2, ista količina ATP omogućava sintezu svega oko 5 g biomase. Kultura E. coli na mineralnoj podlozi sa glukozom, kao jedinim izvorom ugljenika, za sintezu 1 g biomase utroši oko 35 mmola ATP. Najveći deo, oko 20 mmola, koristi se za polimerizaciju aminokiselina (sintezu proteina). Sledeći proces, po udelu u potrošnji energije, je enzimsko povezivanje ugljenih hidrata (šećera) i odgovarajućih nukleotida, pri sintezi RNK i DNK, oko 3,5 mmola ATP. Polimerizacija monosaharida troši oko 2 mmola ATP.

Osim za rast, energija se troši i na procese održavanja životne aktivnosti: obnovu ćelijskog materijala, osmotski rad (održavanje gradijenta koncentracije), kretanje ćelije i dr. Stanje minimalne aktivnosti karakteriše stadijum spore, ali ni u njoj aktivnost nije jednaka nuli. Metabolizam bakterijske ćelije u stanju mirovanja je njen bazni metabolizam. Energija baznog metabolizma je energija održavanja životne aktivnosti. Čak i latentno stanje živog organizma je dinamičko i razlikuje se od statičkog stanja neživog sistema. U sporama se koncentracija većine molekula održava dinamički − procese raspada organskih jedinjenja kompenzuju procesi biosinteze, uz prividnu nepromenljivost sistema. Dinamičko stanje odlikuje skoro sve metabolite i strukturne elemente ćelije. U stanju mirovanja promenjena je brzina procesa obnavljanja ćelijskih elemenata. Usporavanjem procesa opada i verovatnoća grešaka u njima (na primer, mutacija, pri sintezi DNK). Pri aktivnom rastu potrošnja energije na procese obnavljanja čini neznatan deo ukupnog utroška energije. Značajan deo energije održavanja životne aktivnosti troši se na osmotski rad. U gornjem primeru energetske potrošnje kulture E. coli, za procese aktivnog transporta utroši se oko 5 mmola ATP, oko 1/7 ukupne energije.

Energija održavanja životne aktivnosti u velikoj meri zavisi i od uslova rasta. Na primer, za Azotobacter vinelandii, koji fiksira azot pri niskom (0,02 bar) i visokom (0,2 bar) parcijalnom pritisku rastvorenog kiseonika, ona varira od 22 do 220 mmola ATP za 1 g biomase, tj. proporcionalna je koncentraciji rastvorenog O2. Ćelija troši više energije za zaštitu od viška kiseonika, koji inhibira enzimski sistem fiksacije molekulskog azota. Energija održavanja životne aktivnosti iznosi oko 10-20 % energetskih rashoda ćelije. Postoje uslovi (na primer, stanje spore) kada udeo energije održavanja životne aktivnosti u ukupnoj energetskoj potrošnji iznosi i do 90 %.

1.5.4. Energetske zalihe u ćeliji. Prokarioti, koji raspolažu najsavršenijim sistemima dobijanja energije (disanje, fotosinteza), sposobni su za generisanje znatno veće količine energije od potreba. To nalaže neophodnost skladištenja energije. U molekulima ATP energija se ne čuva dugo. Prosečni vek molekula ATP iznosi oko 0,3 s. Energija u formi TGP se, takođe, ne može nagomilavati. Kretanje H* nasuprot gradijentu moguće je do postizanja određenog nivoa, kada razlika u koncentraciji i potencijalu zaustavlja dalje kretanje protona. U ATP i TGP je mobilna energija, koja zadovoljava trenutne potrebe ćelije. Trajno skladištenje energije kod prokariota obezbeđuje se sintezom rezervnih materija, redukovanih polimera (polisaharida, lipida, polipeptida). Rezervne materije su smeštene u granule sa proteinskim omotačem, koji sprečava osmotsku aktivnost zaliha, kako samo skladištenje ne bi zahtevalo utrošak energije za osmotski rad.

1.6. Organizam i metabolizam

Isti zakoni upravljaju živim i neživim svetom. Od atoma do višećelijskih organizama složenost sve više raste ne linearnom kombinacijom, već integracijom nižih u više sisteme. Na najosnovnijem nivou, elementi su tako „odabrani“ da se podjednako uspešno uklapaju i funkcionišu u svakom sistemu, svih nivoa složenosti, omogućavajući posebnost svakom nivou kao novom pragu integriteta, stabilnosti i samostalnosti u odnosu na okruženje.

Najjednostavnija bakterijska ćelija funkcioniše po istom principu kao i složeni višećelijski organizam. Razgrađujući hranu, oslobađa energiju, sadržanu u njenim strukturama, povećava neuređenost molekula. Na račun oslobođene energije od mnoštva dobijenih delova supstrata stvara novi poredak, strukturu ćelije, organizma. Mobilnost energije, pri reorganizaciji materije, je u srži života.

Organizmi, objekti žive prirode, sastoje se od neživih molekula. Najočitija odlika organizma je složenost. Svaki organizam, čak i najmanji, najjednostavniji jednoćelijski, sastoji se od velikog broja različitih molekula. Živi svet se sastoji od mnoštva različitih organizama, jedinki. Skoro da nema molekula u prirodi, koji se ne bi mogao naći u nekom organizmu u određenoj funkciji.

U neživom svetu molekuli i hemijske reakcije nemaju nikakvu funkciju − postoje, odnosno, odvijaju se po sebi. Nasuprot tome, organizam poseduje složenu, materijalnu i prostornu uređenost − strukturu u kojoj svaki deo raspolaže odgovarajućom funkcijom, koja obezbeđuje opstanak celine, poseduje svrsishodnost − teleonomiju. Zahvaljujući već samoj strukturi, sistem je više od prostog zbira delova. Organizovanost kretanja materije u prostoru i vremenu, odnosno, organizovanost molekula i usaglašenost hemijskih reakcija je način postojanja organizma kao otvorenog sistema. Uređenost reakcija i mehanizama regulacije u organizmu obezbeđuje uvek primeren odgovor sistema kao celine na promene sredine.

Kao otvoreni sistem organizam opstaje uz neprekidnu razmenu energije i materije sa okolinom − metabolizam. Metabolizam predstavlja sveukupnost procesa, koji se odvijaju u organizmu u cilju samoodržanja i samoreprodukcije. Organizam predstavlja samoreprodukujući otvoreni sistem. Organizam je fabrika koja ne produkuje, već reprodukuje. Fabrika koja ima jedan jedini cilj i poseduje know how i svu opremu za realizaciju tog cilja − da stvori jedan jedini proizvod, novu, gotovo istu fabriku u što više primeraka. Za razliku od obične fabrike, skupe i glomazne, sa procesima pod visokim pritiskom, pri visokoj temperaturi, uz ogromne gubitke u energiji, sa slabim učinkom, ćelija u minijaturi obavlja istu prirodu posla, hiljade različitih procesa ali pri telesnoj temperaturi, atmosferskom pritisku, sa gotovo stopostotnim učinkom. Izgradnja ovih, skoro savršenih fabrika se ne zasniva na nekom misterioznom principu, nisu potrebne nepoznate sile ni neotkriveni zakoni fizike, neki „poseban faktor“, koji nije sadržan u samoj prirodi sastojaka. Razlika između fabrike, koju je stvorio čovek, i organizma nije u njihovoj prirodi ni u prirodi posla koji obavljaju, već u organizaciji i složenosti.

U organizmu, “fabrici fabrfka“, efikasnost tehnološkog procesa može poslužiti kao uzor savremenim projektantima. Primenjena tehnologija ako i nije najsavršenija moguća u prirodi, sama teži savršenstvu, evoluira po veoma jednostavnom principu − autoreplikacija je dovoljno stabilna da prenese stečene, važne osobine za dobro funkcionisanje sistema iz generacije u generaciju i istovremeno, dovoljno labilna da obezbedi raznolikost potomaka za prirodnu selekciju. Evolutivnost strukture i procesa je formula života, koja obezbeđuje njegov opstanak, uz sve veću složenost, funkcionalnu i energetsku efikasnost a samim tim i sve veću autonomnost u odnosu na okruženje. Filogeneza se može smatrati procesom povećanja stepena uređenosti sistema (složenosti oblika života, organizama) na račun smanjenja slobodne energije i povećanja entropije okruženja.

Organizam obezbeđuje integraciju trajnih naslednih osobina, postojanih uputstava za izgradnju i funkcionisanje strogo definisane strukture sa fleksibilnošću prema novonastaloj situaciji u životnoj sredini, hranljivoj podlozi.

Ovu sposobnost organizma obezbeđuje fleksibilnost strukture i reverzibilnost funkcije enzima, koja oscilira između stanja aktivnosti i neaktivnosti pomoću slabih hemijskih veza. Slabe veze zahtevaju neznatne energetske promene pri raskidanju i stvaranju. To omogućava maksimalnu energetsku ekonomičnost organizma, pri integraciji zapisa u genima, sa promenama u citoplazmi i doprinosi obezbeđenju organizma od narastanja nereda.

Metabolizam ima dve dimenzije − energetsku i materijalnu. Može se govoriti o energetskom i strukturnom metabolizmu. Energetski metabolizam je proces transformacije primljene energije iz sredine u elektrohemijsku ili hemijsku energiju neophodnu za sve energetski zavisne procese, aktivnosti organizma. Strukturni metabolizam je proces izgradnje delova organizma od primljene materije. Za odvijanje ovog procesa neophodan je utrošak slobodne energije iz sredine, transformisane i akumulirane u molekule ATP ili druga energijom bogata jedinjenja dostupna organizmu.

U literaturi se često za označavanje energetskih i strukturnih procesa koriste termini “katabolizam“ i “anabolizam“, koji se odnose na proces razgradnje, odnosno, sinteze organskih molekula, uz dobijanje tj. utrošak slobodne energije. Pojam katabolizma, međutim, nije primenjiv na sve vidove razmene energije, na primer, na fotolitoi hemolitotrofiju. Energetski metabolizam organizama fotolitotrofa i hemolitotrofa nije vezan za razgradnju organskih materija. U ovim organizmima odvija se samo jedan tok transformacije ugljenikovih jedinjenja − anabolizam.

Metabolizam, energetski i strukturni, odvija se u tri faze. U prvoj fazi delovanju su izloženi prispeli supstrati iz spoljašnje sredine. Ova faza se i naziva perifernim (primarnim) metabolizmom. Dalje enzimske reakcije dovode do stvaranja međuproizvoda, intermedijarnih (sekundarnih) metabolita − faza intermedijarnog (sekundarnog) metabolizma. U poslednjoj fazi, u finalnom metabolizmu, stvaraju se krajnji proizvodi metabolizma − finalni metaboliti. U ovoj fazi finalni metaboliti strukturnog metabolizma se ugrađuju u strukturu organizma, dok se finalni metaboliti energetskog metabolizma izdvajaju iz organizma u spoljašnju sredinu.

Strukturni i energetski procesi u organizmu se odvijaju istovremeno. Povezanost ovih procesa je višestruka. Energetska povezanost se ogleda u primeni dobijene energije za biosintezu i druge procese u organizmu, koji su uslovljeni utroškom energije. Osim energije, za odvijanje reakcija biosinteze često su neophodni agensi poput vodonika (elektrona) čiji su izvor, takođe, reakcije energetskog metabolizma. Treća povezanost energetskog i strukturnog metabolizma ogleda se u tome da pojedini intermedijarni metaboliti i reakcije mogu biti zajedničke (metaboliti, reakcije u dvostrukoj funkciji). Ovo omogućava racionalno korišćenje sekundarnih metabolita i reakcija u svim procesima metabolizma. Metaboliti sa više funcija su amfiboliti, a reakcije amfiboličke. Ključni metaboliti na mestima ukrštanja različitih metaboličkih puteva su centroboliti.

Metabolizam, čak i najjednostavnijih jednoćelijskih organizama (prokariota), odlikuje se izuzetnom raznolikošću, kojaje u vezi sa sposobnošću korišćenja različitih izvora energije i materije. Ta sposobnost je omogućena veoma raznorodnim sastavom perifernih enzimskih sistema primarnog metabolizma. Za razliku od primarnog, intermedijarni metabolizam svih organizama je daleko podudarniji. U okviru te uniformnosti, prokarioti poseduju veći broj rešenja energetskog metabolizma, nego viši organizmi − eukarioti. Svi vidovi metabolizma, koji danas egzistiraju, mogu se naći samo na nivou organizacije prokariotske ćelije. Evolucija metaboličkih procesa odvijala se u pravcu sve uže specijalizacije.

Po prirodi spoljašnje energije, koju mogu koristiti, prokarioti mogu biti fototrofi (izvor energije − svetlost) i hemotrofi (izvor energije − hemijske oksido-redukcione reakcije). Litotrofi su organizmi u kojima su izvor (donor) elektrona u energetskom metabolizmu neorganska jedinjenja (grčki: lito-, kameno-; trophe, hrana). Organizmi u kojima se kao izvori elektrona koriste organska jedinjenja su organotrofi. Na osnovu kombinacije izvora energije i izvora elektrona, postoje četiri osnovna vida energetskog metabolizma: hemolitotrofi i hemoorganotrofi, odnosno, fotolitotrofi i fotoorganotrofi.

Strukturni metabolizam razvrstava organizme na osnovu izvora ugljenika koji koriste na autotrofe i heterotrofe. Autotrofi su u stanju da sami sintetišu sve neophodne komponente svog organizma iz CO2, dok za heterotrofe izvor ugljenika mora biti organsko jedinjenje (grčki: autos, sam; heteros, drugi, drugačiji). Dok je pojam autotrofije precizan i dobro definisan pojam, pojam heterotrofije obuhvata organizme koji se u širokom spektru razlikuju u svojim potrebama u ishrani − od obligatnih parazita do oligotrofnih formi. U svetu prokariota ne postoji oštra granica između auto-, i heterotrofnih organizama. Praktično, nema jedinjenja ugljenika, koje ne bi moglo biti korišćeno kao izvor ugljenika od strane neke grupe prokariota.

Na osnovu ovih razmatranja mogu se razvrstati osam vidova metabolizma, načina života (tabela 8).

Tabela 8. Vidovi metabolizma

Izostavljeno iz prikaza

• Izvor energije
  Donor elektrona
  Neorganska jedinjenja (H2, H2S, NH3, Fe2+ i dr.)
  Organska jedinjenja
  Neorganska jedinjenja (H2O, H2S, S i dr.
  Organska jedinjenja
• Izvor ugljenika Predstavnici
  CO2 Prokarioti
  Organska jedinjenja Prokarioti
  CO2 Prokarioti Prokarioti,
  Organska Eukarioti jedinjenja (Životinje, Gljive)
  CO2 Prokarioti, eukarioti (više biljke)
  Organska jedinjenja Prokarioti
  CO2 Prokarioti
  Organska jedinjenja Prokarioti
  Izvor ugljenika Vid metabolizma
  CO2 Hemolito Autotrofija
  Organska jedinjenja Hemolito Heterotrofija
  CO2 Hemoorgano Autotrofija
• Organska jedinjenja Hemoorgano Heterotrofija
  CO2 Fotolito Autotrofija
  Organska jedinjenja Fotolito Heterotrofija
  CO2 FotoorganoAutotrofija
  Organska jedinjenja FotoorganoHeterotrofija

Neki organizmi mogu opstati samo po jednom vidu − obligatna forma metabolizma. Miksotrofna forma je sposobna da se prebaci sa jednog načina ishrane na drugi ili istovremeno koristi oba izvora ugljenika (CO2 + organska jedinjenja) i energije (svetlost + redoks reakcije). Zastupljenost vidova metabolizma u živom svetu nije ravnomerna − najveći broj prokariotskih vrsta spada u hemoorganoheterotrofe, dok se svet eukariota specijalizovao i svrstao u samo dve grupe: fotolitoautotrofe i hemoorganoheterotrofe, komplementarne za kruženje materije u prirodi i korišćenje energije Sunca za životne procese.
Ako se podaci iz tabele 8 uporede sa podacima sa slike 29, može se zapaziti da su eukariotski hemoorganoheterotrofi, Homo (čovek) i Saccharomyces (kvasac) u bližem srodstvu nego kvasac i bakterije, na primer, Escherichia i Bacillus iz iste grupe hemoorganoheterotrofa. Čovek i kvasac su srodniji čak i fotolitoautotrofnoj biljci Zea (kukuruz), nego prokariotima iz svoje grupe po vidu metabolizma.

• Escherichia/Bacteria
• Bacittus
• Syncchococcus
• Chloroflexus
• Thermotoga
• Pyro dictiiim
• Thermoproteus
• Thermococcus
• Methanococ cus thanobacteriu
• Methanomicrobium \ Euryarchaeota
• Halobacterium
• Bacteriodes
• Methanomicrobium \ Euryarchaeota
• Halobacterium
• Homo Zea
• Saccharomyces Paramecium
• Trypano s oma Vairimorpha

Slika 29. Filogenetsko stablo organizama na osnovu homologije sekvenci rRNK male subjedinice ribozoma (ssrRNA) − Olsen G.J., 2004.

Izostavljeno iz prikaza

Evolucija organizama se ostvaruje preko duge povratne sprege prirodne selekcije, koja kvalitet organizma reguliše preko kvantiteta potomstva. Osnovni kriterijum za prirodnu selekciju je efikasnost razmnožavanja. Svaka promena, koja i najmanje doprinosi brojnosti populacije, ostaje zapisana u genetskom programu. Promenama obrnutog efekta se gubi trag, one iščezavaju. Svaki genom predstavlja nagomilani niz uspeha u toku uzdizanja do svog ogranka po evolutivnom stablu. Svaka promena, koja doprinosi razmnožavanju, bilo prirodna, bilo veštačka, ostaće trajno zapisana u memoriji genetskog materijala. To nalaže posebnu odgovornost i smotrenost pri oplemenjivanju vrsta, genetskim manipulacijama. U toku razvića jedinke, “ubrzano se čita“ ceo zapis od samog početka − razviće svakog pojedinačnog organizma ponavlja pređeni evolutivni put od začetka života kao jedinstvene pojave, ontogeneza predstavlja “sažetu verziju1′ filogeneze.

Postoje geni, na primer, geni enzima glikolize, stari više milijardi godina, stariji i postojaniji od stena i planina, koji i danas funkcionišu nepromenjeno u svim organizmima − od bakterija do čoveka. Postojanost istih gena u toliko različitih organizama na najbolji način ukazuje na princip života. Pojava života je imala svoje postanje, od tada traje neprekidno u nizu pokoljenja, kroz bezbroj različitih organizama koji ovom fenomenu obezbeđuju stabilnost na osnovu promenljivosti, nesavršene reproduktivnosti, obilja varijacija pojavnih oblika i postojanost po cenu vlastite prolaznosti.

Smrt nije imanentna životu. Smrtni su organizmi, smrtnost je individualna osobina. Mikroorganizmi, kao i kulture ćelija višećelijskih organizama, mogu se održavati i razmnožavati beskonačno. Ne postoji sila koja bi pokretala, usmeravala i prekidala proces. Postoji samo neprekidno izvršavanje programa, koji se sve više samoobezbeđuje − evoluira.

Radi veće stabilnosti postojanja, evolucija je unapređivala različitost i promenljivost oblika života. Razvijali su se sve efikasniji mehanizmi obezbeđivanja promenljivosti − usložnjavanjem genetskog materijala, razvijanjem mehanizama rekombinacije, otvaranjem cikličnog molekula DNK, diferencijacijom polova, sistemima za sprečavanje samooplodnje, inbridinga itd. Svaka promena, koja doprinosi diverzitetu, dobro je došla, ali svaku od njih čeka jednako objektivan i neumoljiv sud prirodne selekcije. To je sud koji vrednuje ne toliko samu nastalu promenu, koliko njen značaj za organizam i za život u celini, sud koji svoju pravičnost zasniva na vrlo jednostavnim kriterijumima, univerzalnim zakonima, i pritom nije naklonjen ni jednoj od nastalih varijanti, ma koliko imala visoko mišljenje o sebi.

1.7. Regulacija metabolizma prokariota

Živi, intaktni organizam predstavlja otvoreni, složeni sistem usaglašenih reakcija, sistem koji raspolaže sposobnošću samoregulacije i samoreprodukcije.

Sve reakcije metabolizma su regulisane. Svaka pojedinačna reakcija je pod višestrukom kontrolom, efikasnost regulacionih mehanizama u ćeliji je veoma visoka. Time je obezbeđen uvek primeren odgovor organizma kao celine na promene uslova sredine i omogućeno maksimalno iskorišćenje resursa, sprečen nedostatak i stvaranje viškova intermedijarnih i finalnih metabolita. U zavisnosti od faktora sredine, organizam je sposoban da smanji ili intenzivira sintezu metabolita i stvaranje neophodne forme energije za životne procese.

U organizmu su gotovo sve reakcije katalizirane enzimima. Regulacija metabolizma se svodi na regulaciju brzine enzimskih reakcija. To se postiže na dva načina: promenom aktivnosti, efikasnosti korišćenja katalitičkog potencijala enzima i/ili promenom količine enzima.

1.7.1. Regulacija aktivnosti enzima. Faktori koji utiču na aktivnost enzima su brojni i različiti (slika 30).

Fizički faktori (temperatura, pritisak, magnetno polje, električni impulsi) izazivaju manje specifične efekte od hemijskih. Hemijski faktori deluju različito. Pojedine supstance − kofaktori, analozi supstrata, kompetitivni inhibitori se vezuju za aktivne centre i utiču na katalitičku aktivnost enzima. Druge supstance mogu izazvati modifikaciju aktivnosti, vezivanjem za specifična mesta van aktivnog centra enzima.

Aktivnost pojedinih enzima je regulisana hemijskom modifikacijom samog molekula enzima. Za enzim se kovalentno, ali reverzibilno, vezuje funkcionalna grupa koja izaziva promenu aktivnosti enzima. Na primer, glutaminsintetaza E. coli, koja katalizira sintezu glutamina, postoji u dva oblika koji se razlikuju po tome što je za jedan od njih vezan ostatak adenilne kiseline. Kovalentno vezivanje, koje omogućava enzim modifikator, dovodi do stvaranja manje aktivne, adenilirane forme glutaminsintetaze:

• Faktori uticaja
• Na aktivnost enzima
• Faze mogućeg uticaja na
• Kolicinu enzima
• Alostericni efektori
• Vezivanje sa regulatornim centrom c (Alostericna regulacija)
• Transkripcija
• Supstrat, kofaktor, kompetitivni inhibitor i dr.
• Vezivanje sa ( katalitickim centrom
• Kovalentna modifikacija
• Temperatura, svetlost, elektro uticaj
• Fizički faktori
• Supstra
• Translacija
• Sastavljanje enzima
• Razgradnja enzima
• Enzim
• Supstrat
• Proizvod

Slika 30. Regulacija enzimskih reakcija

Izostavljeno iz prikaza

Glutaminsintetaza -AMP → moditikator +AMP Glutaminsintetaza
(aktivna forma) (neaktivna forma)

Udaljavanje adenilne grupe značajno povećava katalitičku aktivnost enzima. Analogni mehanizam regulacije aktivnosti, pripajanjem i udaljavanjem ostatka sirćetne kiseline (acetiliranjem-deacetiliranjem), deluje i kod enzima citratliaze, fotosintetske bakterije Rhodopseudomonas gelatinosa. U ovom slučaju aktivna je acetilirana forma.

Najbrži, najtačniji i najprecizniji je mehanizam regulacije aktivnosti alosteričnih enzima. Alosterični enzimi, po pravilu, kataliziraju ključne reakcije na početku, na mestima grananja i spajanja metaboličkih puteva. Alosterični enzimi “registruju” potrebu ćelije za finalnim proizvodom procesa. Kada se proizvod nađe u višku, on inhibira aktivnost prvog (alosteričnog) enzima svog biosintetskog puta.

Termin “alosterična inhibicija” uveli su Žakob i Mono (Jacob F., Monod J., 1963.) za označavanje tipa regulacije aktivnosti enzima inhibitorom, koji se po obliku razlikuje od supstrata. Alosterični enzimi su složeni proteinski makromolekuli, koji se najčešće sastoje iz više istih ili različitih subjedinica. Alosterični enzim raspolaže katalitičkim i regularornim (alosteričnim) centrom. lako su katalitički i regulatorni centar u molekulu alosteričnog enzima prostorno razdvojeni, oni su funkcionalno povezani. Katalitička aktivnost alosteričnog enzima se menja usled vezivanja odgovarajućeg molekula regulatora, efektora za regulacioni centar. Efektori mogu biti finalni proizvodi datog metaboličkog puta ili nekog od srodnih puteva, kao i supstrati enzima. Ukoliko dejstvo efektora dovodi do snižavanja aktivnosti enzima, radi se o negativnom efektoru − inhibitoru. Sam supstrat je najčešće pozitivni efektor − aktivator enzima. Negativni efektori se najčešće razlikuju od supstrata, proizvoda ili kofaktora enzimskih reakcija, koje regulišu.

Dejstvo regulatora najčešće se odražava na početnu fazu enzimske reakcije, na stvaranje specifičnog kompleksa enzim-supstrat. Vezivanje efektora za alosterični centar dovodi do promena molekula enzima na nivou tercijalne strukture, koje su detaljnije opisane u poglavlju o enzimima (slika 31).

Slika 31. Vezivanje enzima (1) sa supstratom (1) (A), delovanje negativnog (B) i pozitivnog (C) efektora (D) na katalitičku aktivnost alosteričnog enzima

Izostavljeno iz prikaza

Najjednostavniju alosteričnu regulaciju predstavlja regulacija aktivnosti prvog enzima finalnim proizvodom biosintetskog puta. Krajnji proizvod u višku gasi aktivnost prvog enzima u procesu retroinhibicije, inhibicije povratnom spregom (feedback inhibitiori). Primer takve regulacije je inhibicija biosinteze L-izoleucina. Transformcija L-treonima u L-izoleucin uključuje niz od pet uzastopnih enzimskih reakcija (slika 32).

• a-ketobuterna
• L-izoleucin kiselina

Slika 32. Regulacija biosinteze L-izoleucina mehanizmom negativne povratne sprege

Izostavljeno iz prikaza

Prvu reakciju procesa katalizira alosterični enzim (E. − L-treonindezaminaza. Ovaj enzim inhibira isključivo finalni proizvod − L-izoleucin. Na površini molekula treonindezaminaze nalaze se dva regiona: aktivni centar za vezivanje supstrata L-treonina i regulacioni centar za vezivanje L-izoleucina.

U razgranatim putevima biosinteze, kakve predstavlja većina biosintetskih procesa, mehanizmi regulacije retroinhibicijom se usložnjavaju, aktivnost prvog enzima zavisi od biosinteze više finalnih proizvoda. Princip regulacije mora obezbediti da višak jednog od proizvoda ne izazove nedostatak ostalih. U regulaciji aktivnosti alosteričnog enzima angažovanog u sintezi više proizvoda, učestvuju svi proizvodi. Kada je prva reakcija procesa katalizirana jednim alosteričnim enzimom, na površini molekula enzima mora biti više vezivnih mesta. Svaki od njih odgovara određenom proizvodu, efektoru. Pri tome postoje dve varijante mehanizma inhibicije:

-vezujući se pojedinačno za svoj alosterični centar, ni jedan krajnjii proizvod, efektor, ne menja aktivnost enzima; za inhibiciju enzimske aktivnosti neophodno je vezivanje svih krajnjih proizvoda istovremeno − multivalentna inhibicija;
-svaki finalni proizvod, vezujući se za regulacioni centar, izaziva delimičnu inhibiciju aktivnosti enzima; Istovremeno prisustvo više krajnjih proizvoda dovodi do povećanja inhibitornog efekta; Svaki inhibitor deluje nezavisno od drugih, ali se njihov efekat sabira − kumulativna ili aditivna inhibicija.

Pojedini alosterični enzimi mogu postojati u više različitih molekulskih formi − izoenzima. Izoenzimi kataliziraju istu reakciju, oni su izofunkcionalni ali imaju različita regulatorna svojstva. Izoenzimi imaju jednake katalitičke, ali različite regulacione centre. Svaki enzim kodira poseban gen. Geni izoenzima se često nalaze na različitim mestima (lokusima) bakterijskog hromozoma. Svaki finalni proizvod, nezavisno od drugih, inhibira aktivnost svog izoenzima.

Primeri pomenutih načina inhibicije mogu se naći u regulaciji sinteze aromatičnih aminokiselina triptofana, tirozina i fenilalanina kod Escherichia coli i Bacillus subtilis (slika 33 a, b).

Osnovni, zajednički deo sinteze aromatičnih aminokiselina čine sedam uzastopnih enzimskih reakcija. Tačku grananja puta predstavlja horizmat. Od horizmata se razdvajaju putevi, koji vode ka sintezi aromatičnih aminokiselina, vitamina (para-aminobenzoeve kiseline, vitamina K i dr.), kao i drugih jedinjenja (ubihinona). Sistem sadrži izoenzime i multienzimske komplekse. Prvi enzim (Ei) osnovne deonice puta sinteze aromatičnih aminokiselina, alosterični enzim 3-dezoksi-D-arabinoheptulozonat-7-fosfat-sintetaza (DAHP-sintetaza) katalizira reakciju kondenzacije eritrozo-4-fosfata i fosfoenolpiruvata. Kod E. coli ovu reakciju kataliziraju tri izoenzima, svaki je podložan inhibiciji odgovarajućom aminokiselinom.

• D-Eritrozo-4-fosfat
• Fosfoenolpiruvat
• 3-dezoksi-D-arabinoheptulozonat-7-fosfat DAHP
• 5-dehidrohinat
• DHQ
• Reakcija
• 5-dehidrošikimat
• DHS
• inhibicija
• D-šikimat
• SHK
• Regulacija
• Antranilaf
• ANT
• U 5
• D-šikimat-3-fosfat
• represija
• 5-enolpiruvat-šikimat-3-fosfat ESP
• Horizmat
• CHE
• N-5-Fosforibozil-antranilat
• Karboksgenijpmino-1 -dezoksiri6uloio-5-fosfat gpRt
• lndol-3-glfebrofosfat IGP -BE-
• L-Triptofan
• Prefenat
• 5. PPA
• Fenilpiruvat PP
• E,5
• 4-Hidroksifenil-piruvat
• HPP
• L-Fenilalanin
• L-Tirozin

Slika 33 a. Biosinteza aromatičnih aminokiselina kod E.coli

Izostavljeno iz prikaza

U B. subtilis DAHP-sintetaza (E1) je prisutna u jednoj formi, koja je pod inhibitornom kontrolom od strane dva međuproizvoda sinteze aminokiselina − horizmata i prefenata, koji imaju kumulativno dejstvo na DAHP-sintetazu. Mehanizam inhibicije ovog enzima kod B. subtilis predstavlja primer uzastopne, konsekutivne inhibicije − triptofan inhibira antranilatsintetazu (E8) što dovodi do nakupljanja horizmata.

• D-Eritrozo-4-fosfat
  Fosfoenolpiruvat
  3-dezoksi-D-arabinoheptulozonat-7-fosfat
  DAHP
  5-dehidrohinat
  REAKCIJA
  DHQ
  UE
  5-dehidrošikimat
  inhibicija DHS
• D-šikimat
  REGULACIJA
  SHK ac indukciia
  D-šikimat-3-fosfat
  5-enolpiruvat-šikimat-3-fosfat
  ESP
  Horizmat
  Prefenat
  PPA
  Eu
  Antranilat
• ANT
  N-5-Fosforibozil-antranilat
  PRA
  Karboksifenilamino-1- 5
  dezoksiribulozo-5-fosfat
  CDRP
  Fenilpiruvat
• 4-Hidroksifenil-piruvat
  PP i HPP
  E12 i E7
  L-FENILALANIN
  L-TIROZIN
  indol-3-qlicerofosfat 5
  IGP
  UE2
  L-TRIPTOFAN

Slika 33 b. Biosinteza aromatičnih aminokiselina kod B. subtilis

Izostavljeno iz prikaza

Na slici 33 a i b: E,-DAHP-sintetaza, E2-DHQ-sintetaza, E3-DHQ-dehidrataza, E4-DHS-dehidrogenaza, E5-SHK-kinaza, E6-ESP-sintetaza, E7-CHE-sintetaza, Ea-ANT-sintetaza, Eg-PRA-transferaza, E10-PRA-izomeraza, En-IGP-sintetaza, E12-Triptofansintetaza, E13-CHE-mutaza, E14-PPA-dehidrataza, E15-Fenilalaninaminotransferaza, E16-PPA-dehidrogenaza, E17-Tirozinaminotransferaza E, E2 Fenilalanin i tirozin inhibiraju prefenatdehidratazu (E14), odnosno, prefenatdehidrogenazu (E16), usled čega se javlja višak prefenata.

Kada količina horizmata i prefenata dostigne prag inhibitorne koncentracije, zaustavlja se aktivnost DAHP-sintetaze (E).

Ogranak biosinteze triptofana od horizmata se sastoji od pet uzastopnih reakcija (slika 33 a, b). Kod B. subtilis enzimi, koji kataliziraju ove reakcije, ne stvaraju multienzimske komplekse, dok su kod E. coli prisutna dva kompleksa, koja stvaraju prvi i drugi (E8E9), odnosno, treći i četvrti enzim (E1-E2) ogranka triptofana. Alosterični enzim triptofanovog puta kod B. subtilis − antranilatsintetazu (E8) inhibira triptofan. Kod E. coli pod alosteričnom regulacijom je multienzimski kompleks, koji se sastoji iz antranilatsintetaze i fosforiboziltransferaze (E8-E9).

Put biosinteze tirozina i fenilalanina počinje horizmatom, iz horizmata se stvara prefenat. Ovu reakciju katalizira horizmatmutaza (E13). Transformacija horizmata u prefenat je zajednička reakcija sinteze tirozina i fenilalanina. Kod E. coli horizmatmutazu predstavljaju dva izoenzima, jedan u kompleksu sa sledećim enzimom fenilalaninskog puta − prefenatdehidratazom (E13-E14), a drugi sa sledećim enzimom tirozinskog puta (E13-E16) − prefenatdehidrogenazom. Stvorivši kompleks, izoenzimi su pod uticajem finalnog proizvoda svog ogranka. Za razliku od E. coli, kod B. subtilis horizmatmutaza ne stvara komplekse sa narednim enzimima. Ona čak nije ni alosterični enzim. Kod B. subtilis regulatorni su samo prvi enzimi individualnih ogranaka biosinteze tirozina i fenilalanina (E16 i E14).

Alosterični enzimi koji kontrolišu biosintezu aromatičnih aminokiseina po mehanizmu retroinhibicije, nalaze se na početku osnovnog dela puta biosinteze, na početku ogranaka ili su strukturno vezani sa prvim enzimima u multienzimske komplekse.

1.7.2. Regulacija sinteze enzima. Regulacija aktivnosti alosteričnog enzima finalnim proizvodom obezbeđuje trenutnu reakciju koja menja prinos proizvoda. Ako je proizvod nepotreban, enzimi koji učestvuju u sintezi su suvišni. Racionalnost ćelijskog metabolizma u ovom slučaju omogućavaju mehanizmi, koji regulišu količinu enzima u ćeliji. Opravdana je sinteza samo enzima koji učestvuju u sintezi neophodnih proizvoda. Količina pojedinog enzima u ćeliji može varirati od nekoliko molekula do nekoliko procenata biomase. Količina enzima u ćeliji je regulisana na više nivoa − na nivou transkripcije, translacije, kao i na nivou sastavljanja (assemblage) ili razgradnje složenog proteinskog molekula enzima (slika 30).

Najsloženiji je mehanizam kontrole količine enzima u toku procesa transkripcije. Specifični hemijski signali iniciraju ili blokiraju prepisivanje određenog dela DNK u iRNK, prenos neophodnih informacija za sintezu određenog enzima. U slučaju indukcije, nakon transkripcije, stvorena iRNK prolazi kroz proces translacije, koji se završava sintezom polipeptidnog lanca, enzima. U toku translacije, redosled nukleotida u DNK gena se prevodi u redosled aminokiselina u polipeptidu, finalnom proizvodu gena. Regulacija sinteze proteina je moguća u svim fazama, počev od započinjanja (inicijacije), u toku odvijanja (elongacije) do završetka (terminacije) procesa. Vreme „života“ iRNK je pod uticajem brojnih efektora, finalnih proizvoda metaboličkih puteva.

Enzim je aktivan samo pri određenoj konformaciji molekula. Brzina uspostavljanja struktura višeg reda, kompletiranja funkcionalno aktivne forme enzimskog molekula, ima značajnu ulogu u regulaciji metabolizma. Brzina degradacije enzimskog molekula je, takođe, pod dejstvom specifičnih signala iz metabolizma i može bitno uticati na koncentraciju enzima u ćeliji.

Prema brzini sinteze, enzimi mogu biti razvrstani u konstitutivne i induktivne. Enzimi koji se sintetišu brzinom koja odgovara dinamici rasta i razmnožavanja i koji su prisutni u ćeliji u gotovo nepromenljivoj koncentraciji su konstitutivni enzimi. Tu spadaju, na primer, enzimi glikolize. Metabolički putevi u kojima učestvuju konstitutivni enzimi se kontrolišu mehanizmima, koji utiču na efikasnost enzima, kao što je, na primer, alosterična inhibicija.

U drugu grupu spadaju enzimi, čija količina u ćeliji znatno varira u zavisnosti od sastava hranljive sredine. Geni koji kodiraju ove enzime se „uključuju“ ili „isključuju“ po potrebi. Bez prisustva svojih supstrata u podlozi, ovi enzimi su prisutni u ćeliji u tragovima. Dodatak supstrata u podlogu izaziva indukciju sinteze odgovarajućeg, induktivnog enzima. Kada se u hranljivoj sredini nađe dovoljno finalnog proizvoda procesa biosinteze, prekida se stvaranje enzima, koji učestvuju u tom procesu − represija finalnim proizvodom. Sinteza ovih enzima biće derepresirana kada koncentracija proizvoda u podlozi opadne. Derepresija je po efektu analogna indukciji enzima.

1.7.2.1. Represija finalnim proizvodom. Regulacija sinteze enzima većine anaboličkih procesa odvija se putem represije i derepresije. Sinteza svih enzima određenog anaboličkog procesa može biti podjednako prigušena − represija može biti koordinirana. Ponekad su enzimi istog procesa u različitoj meri represirani. Sinteza enzima mnogih razgranatih biosintetskih puteva se represira samo zajedničkim dejstvom svih finalnih proizvoda − multivalentna represija. Kada reakciju na osnovnom, zajedničkom delu razgranatog procesa kataliziraju izoenzimi, sinteza svakog od njih je pod kontrolom odgovarajućeg finalnog proizvoda.

DAHP-sinetaza E.coli, koju čine tri alosterična izoenzima, osim retroinhibicije, nalazi se i pod kontrolom represora. Sinteza ova tri izoenzima kontrolisana je nekoordinirano − maksimalni nivoi represije i derepresije katalitičke aktivnosti izoenzima su različiti. Uzrok odsustva koordinacije je u tome, da su geni koji kodiraju izoenzime DAHP-sintetaze razmešteni po hromozomu, svaki gen poseduje svoju kontrolu. Aktivnost enzima predstavlja zbir aktivnosti tri izoenzima od kojih se svaki nalazi pod dvojnom kontrolom (inhibicijom i represijom) određene aminokiseline. Represija drugih enzima osnovnog puta sinteze aromatičnih aminokiselina kod E. coli nije dokazana.

DAHP-sintetaza B. subtilis u značajnoj meri se represira tirozinom, ali maksimalna represija se postiže tek u prisustvu fenilalanina i tirozina. Kod B. subtilis, E. coli i drugih bakterija geni, koji kodiraju enzime bitne za sintezu triptofana, formiraju operon, što objašnjava koordiniranu represiju enzima triptofanskog puta. Kod B. subtilis horizmat indukuje sintezu antranilatsintetaze, fosforiboziltransferaze, a moguće, i ostalih enzima triptofanskog puta. Sintezu izoenzima horizmatmutaze i enzima tirozinskog i fenilalaninskog puta kod E. coli represira odgovarajući finalni proizvod.

Mehanizam represije finalnim proizvodom na nivou transkripcije, razjašnjen je sredinom dvadesetog veka zahvaljujući radovima Žakoba i Monoa (Jacob F., Monod J., 1961.). Dokazali su da se u bakterijskom genomu, pored strukturnih gena, koji kodiraju sintezu enzima, nalaze i geni koji regulišu taj proces, regulatorni geni. Jedan od njih je gen regulator (R), koji reguliše proces transkripcije jednog ili više strukturnih gena. Regulatorni gen kodira sintezu specifičnog proteina − represora. Represor je alosterični protein sa dva centra vezivanja. Jedan od centara prepoznaje određeni redosled nukleotida na delu DNK − genu operatoru (O), dok drugi stupa u interakciju sa efektorom (korepresorom). Represor se vezuje za operator koji se nalazi uz bateriju strukturnih gena. Za razliku od operatornih gena, regulatorni geni su uvek razmešteni na rastojanju od strukturnih gena. Proizvodi regulatornih gena, represori, su proteinski molekuli, koji slobodno difunduju do svog odredišta, mesta delovanja.

Strukturni geni, koji pripadaju istom biohemijskom putu, objedinjeni su u grupu koja sa operatorom čini osnovnu jedinicu transkripcije i regulacije − operon. Strukturni geni operona imaju isti operatorni segment koji je lokalizovan na kraju operona i koordinirano su regulisani od strane istog represora. Operon predstavlja racionalan i efikasan sistem regulacije metaboličkog puta.

Početak transkripcije označava pripajanje RNK-polimeraze, koja katalizira sintezu iRNK, za određeni segment DNK − promotor (P). Kada molekul represora zaposedne operator, pokriva promotor i time sprečava vezivanje RNK-polimeraze i početak transkripcije. Kod prokariota pet gena, koji kodiraju enzime triptofanskog puta, formiraju operon (slika 34).

• slobodni, neaktivni represor
• polipeptidni lanci
• aktivirani represor
• korepresor (triptofan)
• iRNK
• DNK

I. Proizvod gena regulatora (R), neaktivna forma represora nije u stanju da se vezuje za operator (O). Promotorni segment (P) je otkriven, odvija se transkripcija strukturnih gena (E,D,C,B.A).
II. U prisustvu korepresora (triptofana) stvara se aktivni kompleks korepresorrepresor koji se vezuje za operator i pokriva promotor te ne dolazi do transkripcije.

Slika 34. Triptofanski operon E. Coli mehanizam represije finalnim proizvodom

Izostavljeno iz prikaza

Gen regulator obezbeđuje siptezu alosteričnog proteina, represora triptofana, koji je u slobodnom stanju neaktivan. U tom stanju se ne vezuje za operator i ne može sprečiti početak transkripcije. Kada se finalni proizvod metaboličkog puta, triptofan, nagomila iznad određenog nivoa, stupa u interakciju sa represorom i aktivira ga. Aktivirani represor se pripaja operatoru i, pokrivajući promotor, gasi transkripciju triptofanskog operona. Triptofan je korepresor.

Geni koji kodiraju sintezu enzima istog metaboličkog puta mogu biti locirani i na različitim mestima u bakterijskom hromozomu. U tom slučaju sinteza svakog enzima može biti regulisana drugim represorom, odnosno, svaki strukturni gen ima svoj regulatorni gen. Proizvod regulatornog gena će reagovati sa proizvodom metaboličkog puta, korepresorom. Postoji i druga mogućnost, da razmešteni geni istog metaboličkog puta budu regulisani istim represorom. Ova organizacija gena je − regulon. Geni koji kodiraju enzime biosinteze arginina kod E.coli čine funkcionalno povezanu jedinicu, regulon. lako su lokalizovani na različitim delovima hromozoma, njihovu represiju vrši jedan isti represor koji se aktivira argininom.

1.7.2.2. Indukcija sinteze enzima. U regulaciji biosinteze aromatičnih aminokiselina kod B. subtilis horizmat ima indukujući efekat na sintezu enzima triptofanskog puta (slika 33 b). Regulacija indukcijom je karakteristična za kataboličke puteve u kojima ulogu induktora imaju supstrati. Klasičan primer enzima podložnog indukciji supstratom je [3-galaktozidaza E. coli. Kada se kultura E. coli gaji na podlozi sa glukozom, ne usvaja laktozu. Ako se preseje na podlogu sa laktozom, kao jedinim izvorom ugljenika, nakon izvesnog perioda u ćelijama počinje sinteza p-galaktozidaze, koja katalizira hidrolizu laktoze na D-glukozu i D-galaktozu. Ovaj enzim će omogućiti E. coli iskorišćenje laktoze. Vraćanjem kulture na podlogu sa glukozom, sinteza p-galaktozidaze prestaje. Sve ćelije su sposobne za sintezu ovog enzima. Indukcija, dakle, nije aktivacija postojećeg enzima u ćeliji, već akivacija sinteze novog enzima.

Transformacija supstrata se najčešće odvija preko niza uzastopnih enzimskih reakcija:

E1 E2 E3 E4 E5
A→B→C→D→E→F

gde su B,C,D,E međuproizvodi transformacije polaznog supstrata A,

dok je F − finalni proizvod. E1-5 su enzimi koji kataliziraju pojedine faze transformacije početnog supstrata. Postoji više tipova indukcije:

• I. Početni supstrat A je induktor svih enzima procesa, intenziviranje njihove sinteze je istovremeno i koordinirano;
• II. Supstrat A je induktor samo prvog enzima − Ei, dolazi do nakupljanja proizvoda prve reakcije − B. Metabolit B indukuje sintezu enzima E2, što dovodi do nagomilavanja C i indukcije sledećeg enzima E3 itd. Odvija se uzastopna indukcija sinteze enzima metaboličkog puta − konsekutivna indukcija;
• III. U toku kombinovanog mehanizma indukcije, deo enzima se indukuje koordinirano, supstratom, dok ostale enzime indukuju međuproizvodi metaboličkog puta, jedan za drugim, uzastopno.

Egzogena laktoza koordinirano indukuje sintezu tri enzima − galaktozidpermeaze (katalizira transport laktoze u ćeliju), [3-galaktozidaze (katalizira hidrolizu disaharida laktoze na monosaharide glukozu i galaktozu) i transacetilaze. Nagomilana galaktoza indukuje sintezu sledeća tri enzima sopstvenog katabolizma.

Indukcija sinteze enzima je u osnovi sposobnosti adaptacije organizma na različite uslove kultivacije.

Laktozni operon E. coli, koji se sastoji od tri strukturna gena, promotora i operatora, bio je prvi enzimski sistem na kome su Zakob i Mono izučavali mehanizam indukcije sinteze enzima (slika 35).

• I. Gen regulator (R) stvara proteinski represor koji se vezuje za operator (O) i prekriva promotor (P) − nema transkripcije strukturnih gena (z,y,a).
• II. lnduktor (laktoza) inaktivira represor, on gubi sposobnost vezivanja za operator. Promotor ostaje otkriven, dolazi do transkripcije strukturnih gena.

Slika 35. Laktozni operon E. coli\ indukcija sinteze enzima katabolizma laktoze

Izostavljeno iz prikaza

• induktor (laktoza)
• inaktivirani reoresor
• galaktozidaza permeaza trancanotilata
• iRNK
• oolioeotidni lanci
• DNK

Bez laktoze, molekul represora se vezuje za operator i sprečava transkripciju strukturnih gena. Kada se u ćeliji nađe laktoza, ona se vezuje za represor i stvara kompleks sa njim, koji ne može da se veže za operator, indukuje se sinteza enzima razgradnje laktoze. Nakon eliminacije induktora (razgradnje laktoze), represor se ponovo vezuje za operator i prekida se sinteza enzima.

Indukcija sinteze enzima laktoznog operona zasniva se na mehanizmu negativne regulacije − represor sprečava transkripciju gena laktoznog operona. Do indukcije dolazi inaktivacijom alosteričnog represora pomoću efektora − induktora. Pri negativnoj regulaciji indukcije, kao i pri represiji sinteze enzima, interakcija represora sa operatorom dovodi do gašenja transkripcije strukturnih gena. Razlika je u tome, da pri indukciji pomoću negativne regulacije, efektor (induktor) inaktivira represor i time sprečava njegovo vezivanje za operator, dok u slučaju represije, efektor (korepresor) aktivira represor i omogućava njegovo vezivanje za operator.

1.7.2.3. Katabolitna represija. Izvori energije, koji se u ćeliji brzo iskorišćavaju, sprečavaju sintezu enzima, koji učestvuju u transformaciji sporo iskoristivih energenata. Katabolitna represija omogućava ćeliji da prvo koristi dostupnije izvore energije. Ako se u podlozi za kultivaciju (hrani) istovremeno nađu glukoza i, na primer, laktoza, svaki organizam prvo koristi glukozu. Bez obzira na prisustvo laktoze, induktora laktoznog operona, nema sinteze enzima koji učestvuju u razgradnji laktoze. Transkripcija gena laktoznog operona počinje tek kada opadne koncentracija glukoze u podlozi. Dvofazni rast ćelijske kulture, koji je uslovljen različitom usvojivošću izvora energije je diauksija (slika 36).

Slika 36. Kriva diauksije

Izostavljeno iz prikaza

• Usvajanje laktoze
• Usvajanje glukoze
• Biomasa
• Vreme

Glukoza sprečava sintezu enzima laktoznog operona, mehanizmom katabolitne represije. Na slici 37 prikazan je mehanizam katabolitne represije koja zavisi od nivoa cikličnog AMP (cAMP) u ćeliji induktor (laktoza) inaktivirani represor.

I. U prisustvu glukoze pored laktoze, uprkos prisustvu induktora (laktoze) koji inaktivira represor, nema sinteze enzima razgradnje laktoze. Nema transkripcije strukturnih gena laktoznog operona zato što je neophodni katabolitni aktivator procesa transkripcije neaktivan i slobodan zbog niskog nivoa cAMP u ćeliji usled prisustva glukoze.
II. cAMP sa katabolitnim aktivatorom stvara kompleks koji se vezuje za promotor i stvara uslove za prihvat RNK-polimeraze i inicijaciju transkripcije.

Slika 37. Mehanizam katabolitne represije

Izostavljeno iz prikaza

U ovom procesu cAMP je efektor, koji stvara kompleks sa alosteričnim proteinom, katabolitnim aktivatorom, koji je u slobodnom stanju neaktivan. Stvoreni kompleks se vezuje za određeni segment promotora. Time se omogućava vezivanje RNK-polimeraze za promotor i početak transkripcije. Količinu kompleksa katabolitnog aktivatora sa cAMP određuje koncentracija cAMP, koja se smanjuje pri povećanju sadržaja glukoze u podlozi. cAMP se stvara u ćeliji iz ATP u reakciji koju katalizira adenilatciklaza vezana za citoplazmatičnu membranu:

• katabolitni aktivator
• iRNK
• polipeptidni lanci
• katabolitni aktivator
• cAMP
• inaktivirani represor
• induktor (laktoza)
• DNK
• cAMP

Padom koncentracije gukoze u podlozi, raste aktivnost adenilatciklaze, intenzivira se stvaranje cAMP i dolazi do indukcije sinteze enzima razgradnje laktoze. Pri visokim koncentracijama glukoze u podlozi dešava se obrnuto − smanjuje se aktivnost adenilatciklaze i količina cAMP opada, sprečava se transkripcija strukturnih gena laktoznog operona. Kada je laktoza jedini prisutan šećer u podlozi, a nivo cAMP u ćeliji dovoljan, sinteza enzima katabolizma laktoze se odvija do razgradnje laktoze (slika 35). Mehanizam prikazan na slici 37 predstavlja dopunu mehanizma na slici 35. Katabolizam glukoze je izvor energije akumulirane u ATP. Glukoza povezuje put ATP sa pulom cAMP u ćeliji − pri povećanju količine ATP smanjuje se količina cAMP i obrnuto. Učešće univerzalnog kompleksa, proteinskog katabolitnog aktivatora sa cAMP u indukciji, svojstveno je svim enzimskim sistemima, koji se nalaze pod kontrolom katabolitne represije.

Biosintetski (anabolički) putevi su regulisani prvenstveno alosteričnom inhibicijom prvog enzima i represijom sinteze enzima finalnim proizvodom. Razgranati biosintetski putevi regulišu se složenom kombinacijom ovih mehanizama.

Osnovni mehanizmi, koji regulišu procese razgradnje (katabolizma) su indukcija sinteze enzima i katabolitna represija. Katabolični putevi u kojima učestvuju konstitutivni enzimi regulišu se, uglavnom, alosteričnim izmenama enzimske aktivnosti. Jedan od osnovnih zadataka kataboličnih puteva je obezbeđenje energije za ćeliju. Kod većine prokariota mogućnost generisanja energije je daleko iznad efektivne potrebe za energijom. Količina ATP, koja bi mogla biti sintetisana raspoloživim enzimima glikolize i disanja kod aerobnih prokariota, znatno je veća od količine, koja je neophodna za proces biosinteze i održavanja životne aktivnosti. Ćelija mora biti sposobna za kontrolu potrošnje energetskih supstrata i proizvodnje energije. Osnovni princip je veoma jednostavan − ATP se stvara samo kada je neophodan. Intenzitet energetskih procesa u ćeliji je regulisan intracelularnim sadržajem ATP.

Adenilni nukleotidi spadaju u najvažnije efektore. AMP i ADP deluju kao pozitivni efektori, koji stimulišu brzinu energetskih procesa i podstiču stvaranje ATP. Nasuprot tome, ATP je negativni efektor, koji signalizira da su procesi stvaranja energije prevagnuli nad potrošnjom. Rezultat regulacije procesa sinteze i razlaganja ATP u ćeliji je održavanje stacionarnog energetskog stanja, koji se definiše energetskim nabojem ćelije:

Vrednost energetskog naboja se matematički može kretati od 1 − kada bi u ćeliji svi adeninski nukleotidi bili u vidu ATP, do 0 − kada bi u ćeliji bilo samo AMP. U kulturi koja raste energetski naboj iznosi 0,8. Smanjenje ove vrednosti ukazuje na slabiju obezbeđenost ćelije energijom. Kada ova vredost opadne ispod 0,5 − nastupa smrt.

Regulacija procesa aktivnog transporta neophodnih supstanci kroz citoplazmatičnu membranu ostvaruje se na nivou sinteze i funkcionisanja prenosnika. Biosinteza proteinskih komponenti mnogih transportnih sistema je regulisana mehanizmom indukcije. Transportni sistem glukoze kod većine prokariota je konstitutivan. Glukoza sprečava stvaranje transportnih sistema za druge šećere i organske kiseline, putem katabolitne represije. Izuzetak čine pojedini obligatni aerobni prokarioti kod kojih je transport organskih kiselina konstitutivan, a induktivan je transportni sistem glukoze. Višak supstrata u podlozi može da represira sintezu odgovarajućeg transportnog sistema. To je posebno prisutno kod aminokiselina. Regulacija transporta je koordinirana sa regulacijom metabolizma. Regulacija transporta je po mehanizmu negativne povratne sprege − supstrat nagomilan u ćeliji sprečava sopstveni transport iz medijuma. Procesi transporta su pod kontrolom istih mehanizama kao i unutarćelijski anabolički i katabolički procesi.

1.8. Genetika i evolucija

Informacije o svim osobinama organizma nalaze se u genetskom aparatu. Stabilnost njegovog funkcionisanja obezbeđuje očuvanje i ispoljavanje naslednih osobina kroz generacije. Stabilnost nije apsolutna, dozvoljava promene, omogućava varijabilnost oblika života i ispoljavanje prirodne selekcije. Bez stabilnosti ne bi bilo nasleđivanja, bez nestabilnosti ne bi bilo evolucije. Bez evolucije i raznolikosti formi postojanja, život “osuđen“ na oblik u kome je nastao, bio bi veoma krhka i nestabilna pojava. Uslov opstanka života je koliko stabilnost, još više labilnost osnovnog plana nasleđivanja i ispoljavanja nasleđenog − genetskog aparata.

Hemijska osnova nasleđa, informacija o svojstvima organizma, sadržana je u specifičnom redosledu povezivanja četiri nukleotida u lanac molekula DNK. Mehanizam replikacije, udvajanja lanca, obezbeđuje sintezu novog lanca na osnovu komplementarnosti baznih parova, koristeći “roditeljski lanac“ kao matricu za sintezu novog polinukleotida. Replikacija dvostrukog lanca polinukleotida omogućava da se nakon deobe u dve novonastale ćelije nađe po jedan kompletan roditeljski i novosintetisani lanac DNK. Time se novim generacijama prenosi gotovo identičan set informacija. Realizacija ovih informacija u procesu životnog ciklusa organizma (ontogeneze) je dvostepeni proces. U prvoj fazi fragmenti DNK se prepisuju (transkripcija) u vidu komplementarnih polinukleotida iRNK, koja prelazi u citoplazmu i vezuje se za ribozome, centre za sintezu proteina. Sinteza proteina u ribozomima predstavlja drugu fazu, prevođenje (translaciju) redosleda nukleotida iRNK u redosled aminokiselina sintetisanog polipeptida. Mada se procesi replikacije i transkripcije tj., sinteze DNK i RNK odvijaju po mehanizmu sinteze po matrici, proces transkripcije poseduje niži stepen tačnosti i pouzdanosti od replikacije. Greške nastale u toku prepisivanja i prevođenja informacija nisu nasledne, za razliku od grešaka replikacije. Greške u transkripciji i translaciji ispoljavaju se samo u datoj jedinki u kojoj su nastale.

Verovatnoća grešaka u translaciji je veća od verovatnoće grešaka pri sintezi RNK, a pogotovo DNK. Najosetljivija faza u procesu sinteze proteina je enzimsko vezivanje aminokiselina za odgovarajuću tRNK. Prema raspoloživim podacima, verovatnoća greške u ovoj reakciji je 10 4. Najnepouzdaniji korak određuje nivo pouzdanosti čitavog procesa. Greške u translaciji, poput grešaka u transkripciji, se ne nasleđuju, ukoliko njihov uzrok nije poremećaj na DNK. Samo se promene u samoj “memoriji“, na ishodnom genetskom materijalu, prenose na novo pokoljenje, ukoliko se replikuju pri sintezi DNK. U osnovi evolucije je promenljivost molekula DNK.

Kod mnogih bakterija DNK se može naći ne samo u hromozomu već i u plazmidima. Plazmidi su vanhromozomski genetski elementi, ciklični molekuli ekstrahromozomalne DNK. Mogu da sadrže od 1500-40 000 nukleotidnih parova. Plazmidi su sposobni za samostalnu replikaciju. Najčešće sadrže gene, koji kodiraju osobine, kao što su osetljivost prema antimikrobnim supstancama, sposobnost transfera gena pri konjugaciji, sinteze antibiotika, asimilacije pojedinih šećera i dr.

Sveukupnost svih gena u genetskom materijalu organizma predstavlja genotip ili genom. Pojam fenotipa obuhvata sve pojavne karakteristike, osobine organizma. Promene fenotipa mogu biti dvojake prirode:

I Adaptacije su promene osobina koje se ispoljavaju kod većine jedinki populacije pri promeni uslova sredine. Adaptacija predstavlja odgovarajuću reakciju organizma na faktor sredine i traje dok deluje faktor koji ju je izazvao;
II Mutacije su promene osobina niske učestalosti u populaciji. Javljaju se u jednoj od 104-1011 ćelija. Ukoliko mutacija donosi prednost, koja se ogleda u bržem rastu i razmnožavanju, mutanti ubrzo potiskuju ishodni tip i postaju dominantni u populaciji. Mutacija je slučajna, nasumična promena, nije adekvatna niti uslovljena promenama u sredini. Mutacije su nasledne promene, koje se prenose na nove generacije i, nezavisno od faktora koji ih je izazvao, traju do reverzije. Letalne mutacije ometaju vitalne funkcije organizma i čine ga nesposobnim za rast i razmnožavanje u konkretnim uslovima.

Novi fenotip, nova svojstva organizma ne moraju biti determinisana u genomu. Ona mogu biti rezultat adaptacije, fleksibilnosti metabolizma i predstavljati krajnji efekat regulatornih mehanizama. Ne menjajući sastav genoma, adaptacije nisu nasledne i nemaju neposrednog udela u evoluciji, sem u meri u kojoj je nasledna osobina sama adaptabilnost. Veća fleksibilnost prema spoljašnjim uticajima obezbeđuje više izgleda za opstanak organizma.

Nasledne osobine mogu biti rezultat mutacije i rekombinacije genetskog materijala.

1.8.1. Mutacije predstavljaju skokovite promene u genetskom materijalu, koje mogu dovesti do pojave novih fenotipskih obeležja, osobina organizma. Još je Darvin (Darwin Ch., 1872.) zapazio sklonost prirode prema „igrama“ (sports). Mutacije često nemaju značajnog efekta na populaciju. Mutacije nepoznatih uzroka se smatraju “spontanim“. Već je pomenuto daje proces hidrolize nukleinskih kiselina spontani proces, koji prati pad slobodne energije.

Brojni fizički i hemijski faktori, koji deluju na genetski materijal, mogu indukovati mutacije i povisiti njihovu učestalost iznad spontanog fona. Spontane mutacije, kao i indukovane nekim mutagenim agensom, predstavljaju promenu jednog nukleotida (“tačkaste mutacije”) ili čitavog fragmenta DNK lanca. Tačkasta mutacija može predstavljati zamenu, izostanak ili višak nukleotida. Mutacije segmenata DNK mogu značajno promeniti količinu gena u genomu.

Ultravioletni zraci, na primer, mogu izazvati kovalentno vezivanje pirimidinskih baza, stvaranje dimera pirimidina. Ređe izazivaju raskid vodoničnih veza i stvaranje poremećenih, aberantnih veza unutar lanca DNK i između DNK i proteina. Jonizujuća zračenja i razni hemijski mutageni, takođe, indukuju stvaranje intra-, i interlančanih veza, narušavanje čak i primarne strukture DNK.

U procesu evolucije, već su kod prokariota razvijeni mehanizmi zaštite genetskog materijala. Kod bakterija su otkriveni izuzetno efikasni sistemi ispravljanja grešaka, mehanizmi reparacije DNK.

Ekspresija mutacija se odvija preko istih mehanizama kao i ispoljavanje svih informacija genoma. Pojedine mutacije se ne odražavaju na osobine organizma, ostaju prikrivene, latentne. Prikrivena može ostati, na primer, mutacija koja ne izaziva promenu primarne strukture proteina, budući da genetski kod sadrži sinonime. Ponekad promene primarne strukture enzimskog molekula nastaju daleko od aktivnog centra i nemaju odraza na katalitičku aktivnost enzima. Promene aktivnosti enzima su moguće u širokom opsegu − od beznačajnih poremećaja do potpunog izostanka dejstva, što može imati čak i letalne posledice za organizam. Za ekspresiju mutacije ponekad je neophodno nekoliko deoba ćelije. Na primer, u slučaju narušene sposobnosti sinteze vitamina tiamina, deficitarnost u tiaminu se ne uočava kroz nekoliko generacija mutanata. U tom periodu mutantne ćelije troše tiamin preuzet deobom sadržaja nemutirane ćelije pretka. Kasnije, mutanti mogu rasti samo uz dodatak tiamina u podlogu.

Na ispoljavanje mutacija utiče i broj kopija hromozoma prisutnih u ćeliji. Prokarioti su haploidni, svi geni su lokalizovani na jednom hromozomu. U određenim uslovima u ćeliji se može naći više kopija istog hromozoma. Ako je u takvoj ćeliji nastala mutacija na jednom primerku hromozoma, na primer, narušena sinteza nekog enzima, neće doći do fenotipske ekspresije, jer će sinteza enzima biti ostvarena funkcionisanjem istog, ali nepovređenog gena na kopijama hromozoma. Za ekspresiju mutacije neophodno je da se ona nalazi na unikatnom (haploidnom) hromozomu ili da je replicirana u svim primercima hromozoma u ćeliji.

1.8.2. Rekombinacije. Nasledne promene osobina mogu nastati i kao rezultat rekombinacije genetskog materijala, pri objedinjavanju genoma dve ćelije. Kod prokariota do rekombinacije genetskog materijala dolazi, uglavnom, pri:

-konjugaciji;
-transformaciji;
-transdukciji.

Pri konjugaciji bakterija u toku neposrednog kontakta dve ćelije, dolazi do prenosa genetskog materijala iz ćelije donora u ćeliju recipijenta. Po pravilu, dolazi do prenosa samo dela genetskog materijala donora, uz stvaranje nepotpunog zigota − merozigota. Preneti fragmenti pronalaze homologe delove na molekulu DNK recipijenta i dolazi do razmene gena (slika 38).

• fragment DNK donora
• deo hromozoma
• recipijenta

Slika 38. Šematski prikaz rekombinacije fragmenata DNK donora i recipijenta

Izostavljeno iz prikaza

Deo DNK donora se integrira u genom recipijenta a odgovarajući fragment recipijentne DNK se isključuje iz hromozoma. Efikasnost integracije DNK, pri konjugaciji, veoma je visoka.

Transformacija predstavlja promenu svojstava bakterijske ćelije pod dejstvom DNK, izolovane iz druge bakterijske ćelije. Sposobnost prodora DNK u ćeliju recipijenta zavisi od prirode DNK i fiziološkog stanja recipijenta. Sposobni za transformaciju mogu biti samo visokomolekularni dvolančani fragmenti DNK. U ćeliju može prodreti DNK različitog porekla, međutim, sposobnost uključivanja u genom ima samo DNK određenog stepena homologije. Nakon pronalaženja homologog fragmenta u ćeliji recipijentu, dolazi do razmene gena, kao pri konjugaciji.

Transdukcija je proces prenosa gena iz jedne bakterijske ćelije u drugu pomoću prenosnika, bakterijskog virusa − faga. Transdukcija je moguća ukoliko u toku razmnožavanja bakterijskog virusa, neki konstitutivni element faga “zahvati” fragment bakterijskog hromozoma, po pravilu, sa malim brojem gena. Kada takav virus zarazi bakteriju recipijenta, preneta bakterijska DNK deli sudbinu virusne DNK u domaćinu − može biti ugrađena u hromozom recipijenta. Prenos genetskog materijala prokariota se ostvaruje i preko vektora − plazmida. Mnogi plazmidi savlađuju barijere, koje postoje između različitih vrsta i rodova bakterija.

Organizacija genetskog aparata prokariota omogućava prenos genetskih informacija iz generacije u generaciju ćelija, “po vertikali”, zahvaljujući stabilnosti zapisa kao i efikasnosti mehanizama prenosa, zaštite i reparacije. Ipak, stabilnost nije apsolutna. PromenIjivost predstavlja imanentno svojstvo genetskog materijala, kao i stabilnost. Pored mutacija, izmene genoma kod prokariota su potpomognute mehanizmima rekombinacije. Prenos gena “po horizontali”, u generaciji, omogućen je procesima konjugacije, transformacije i transdukcije.

Doprinos različitih genetskih procesa evoluciji prokariota može se zapaziti na populaciji organizama. Genetski sastav populacije čini njen genetski fond. Evolucija predstavlja promene u genetskom fondu, koje su rezultat sadejstva genetskih procesa i prirodne selekcije. Nove nasledne osobine u genetskom fondu nastaju kao rezultat mutacija. Mutacije su bile moguće na samom začetku funkcionisanja DNK, kao informacionog molekula − za mutacije nisu potrebne posebne strukturne formacije niti mehanizmi. Sklonost mutaciji obezbeđuje hemijski sastav i struktura DNK. Ekspresija mutacija sledi put ispoljavanja ostalih genetskih informacija.

Brzina evolucije je proporcionalana frekvenci mutacija. Može se pretpostaviti da je na početku biološke evolucije učestalost mutacija bila daleko veća nego danas. Veću učestalost mutacija moglo je obezbediti intenzivno dejstvo kratkotalasnog sunčevog zračenja, kao i odsustvo reparacionih mehanizama kod primitivnih oblika života. “Štetne mutacije” su nestajale, eliminisane prirodnom selekcijom, “korisne” (koje su obezbeđivale veću stabilnost prema promenama u spoljašnjoj sredini, efikasniji rast i razmnožavanje) su se nasleđivale. Evolucija je nagomilavanje korisnih mutacija, nizanje uspeha.

Novi važan korak za evoluciju predstavlja rekombinacija gena, mehanizmi razmene genetskog materijala i nastanak jedinki sa rekombinantnim genomom. Pri rekombinaciji se ne pojavljuju novi geni u genetskom fondu populacije, kao pri mutacijama. Značaj rekombinacija je u objedinjavanju različitih gena, u stvaranju složenijih genoma, koji sadrže brojne varijante kombinacija postojećih gena. Rekombinanti predstavljaju, ipak, “nov materijal” za prirodnu selekciju. Od tri osnovna procesa, koji kod prokariota obezbeđuju rekombinaciju genetskog materijala, najznačajnija je konjugacija, jer obezbeđuje maksimalni obim razmene gena između ćelija. U povoljnim uslovima moguć je prenos kompletne DNK donora u ćeliju recipijenta. Međutim, efikasnost rekombinacije je visoka samo kod dovoljno srodnih prokariotskih organizama, zbog barijera u ćeliji prema ekspresiji stranog genetskog materijala.

Razmena genetskog materijala “po horizontali” raspolaže ograničenim evolutivnim potencijalom. Evolucija prokariota pretežno se oslanjala na mutabilnost u kombinaciji sa razgranatim prenosom svojstava “po vertikali”.