U biološkim istraživanjima koriste se različite metode za izučavanje bioloških procesa, međutim, kada je reč o izučavanju mehanizama, subćelijskih struktura i njihovih funkcija, ona danas nisu moguća bez primene instrumentalnih metoda (stari naziv koji se koristio do polovine ovog veka je fizičko-hemijske metode). Stoga je bilo neophodno da studenti biologije imaju u svom nastavnom planu predmet (Instrumentalne metode u biologiji) i kome bi imali priliku da ovladaju teoretskim osnovama ovih metoda, i da steknu praktična eksperimentalna iskustva.

Posle više od deset godina iskustva u nastavi ovog predmeta za studente biologije na Prirodnom-matematičkom fakultetu u Novom Sadu, koristeći i trideseto-godišnja iskustva u nastavi sličnog predmeta na Tehnološkom fakultetu u Novom Sadu nastala je potreba da se u jednoj knjizi izlože teorijske osnove instrumentalnih metoda kao i da se definišu svi elementi neophodni za samostalan eksperimentalan rad.

S obzirom na to da su autori, koliko dozvoljava materija, vodili računa o predznanju studenata za koje je ova knjiga prevashodno namenjena ona je predviđena kao osnovni udžbenik za studente biologije, agronomije, veterine, medicine, delimično farmacije, dok se kao pomoćni udžbenik može koristiti za studente hemije i tehnologije. Ne sledeći nijednog autora, odnosno prilagođavajući ovaj materijal pre svega studentima Univerziteta, autori su u nedostatku naših termina često (u zagradama) navodili termine koji su u duhu engleskog jezika. Autori nemaju nameru da komentarišu ovu pojavu koja je prisutna svuda u svetu, već samo ukazuju na nju, pri čemu smatraju da nisu načinili omašku.

Pri izboru eksperimenata autori su se rukovodili činjenicama da:
–           imaju upotrebnu vrednost, odnosno da se koriste u biološkim laboratorijama
–           su zastupljeni primeri iz raznih disciplina biologije
–           mogu da se izvedu za 4 časa, koliko obično traju vežbe.

I pored želje da se teorijski i praktično obuhvate metode korisne studentima biologije, naravno i drugih fakulteta, može se pretpostaviti da su neka područja nedovoljno zastupljena. Otuda autori koriste priliku da izraze zahvalnost za sve primedbe i sugestije koje bi poboljšale kvalitet knjige.

Sadržaj

1. METODE RAZDVAJANJA

1.0.      Teoretske osnove hromatografskih metoda
1.1.      Hromatografske metode
1.1.1.   Adsorpciona hromatografija
1.1.2.   Podeona hromatografija
1.1.3.   Hromatografija na izmenjivačima jona
1.1.4.   Hromatografija na molekulskim sitima
1.1.5.   Afinitetna hromatografija
1.1.6.   Hromatografija na hartiji
1.1.7.   Hromatografija na tankom sloju
1.1.8.   Gasna hromatografija
1.1.9.   Visokopritisna i tečna hromatografija
1.2.      Centrifugovanje
Eksperiment 1.3.1.
Spektrofotometrijsko određivanje (3-karotena izdvojenog kolonskom adsorpcionom hromatografijom
Eksperiment 1.3.2.
Razdvajanje smeše šećera hromatografijom na hartiji
Eksperiment 1.3.3.
Razdvajanje smeše aminokiselina hromatografijom na tankom sloju
Eksperimenl 1.3.4.
Razdvajanje i kvantitativno određivanje metil-estara
masnih kiselina gasnom hromatografijom
Eksperiment 1.3.5.
Razdvajanje i kvantitativno određivanje šećera
visokopritisnom tečnom hromatografijom
Eksperiment 1.3.6.
Izolovanje i frakcionisanje subcelularnih organela jetre pacova . .

2. OPTIČKE METODE ANALIZE

2.0.      Teoretske osnove optičkih metoda
2.0.1. Opšti model optičkih metoda analize
2.0.2. Primena optičkih metoda analize u biologiji
2.0.3. Kvalitativna određivanja pomoću optičkih metoda analize
2.0.4. Kvantitativna određivanja pomoću optičkih metoda analize
2.0.5. Fotoelektrična fotometrija
2.0.6. Ultraljubičasta i vidljiva spektrofotometrija
2.0.7. Plamena fotometrija
2.0.8. Atomska apsorpciona spektrofotometrija
2.1.      Mikroskopija
2.1.1.   Teoretske osnove mikroskopije
2.1.2.   Mikroskopska merenja
Eksperiment 2.3.1.
Fotometrijsko određivanje aktivnosti peroksidaze
Eksperiment 2.3.2.
Fotometrijsko određivanje sadržaja nitrata i nitrita u biljnom materijalu
Eksperiment 2.3.3.
Određivanje toka hemolize eritrocita
Eksperiment 2.3.4.
Merenje usvajanja svetlosti od strane biljnih i respiratornih pigmenata
Eksperiment 2.3.5.
Spektrofotometrijsko određivanje sadržaja karbonilnih jedinjenja u prirodnim vodama
Eksperiment 2.3.6.
Određivanje propustljivosti ćelija kvasca u zavisnosti od temperature na osnovu izlaska jona natrijuma iz ćelija
Eksperiment 2.3.7.
Određivanje sadržaja magnezijuma u biološkom
materijalu atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom
Eksperiment 2.3.8.
Određivanje broja ćelija u biljnom tkivu
Eksperim en 12.3.9.
Određivanje broja stoma metodom otiska

3. ELEKTROANALITIČKE METODE

3.0. Teoretske osnove elektroanalitičkih metoda
3.0.1. Potenciometrija
3.0.1.1. Uspostavljanje elektrodnih potencijala
3.0.1.1.1. Redoks elektrode
3.0.1.1.2. Metalne elektrode
3.0.1.1.3. Gasne elektrode
3.0.1.1.4. Membranske elektrode
3.0.1.2. Indikatorske elektrode
3.0.1.2.1. Konstrukcija redoks elektrode
3.0.1.2.2. Konstrukcija membranske-staklene elektrode
3.0.1.2.3. Konstrukcija elektrode responsibilne na ugljen-dioksid
3.0.1.3. Referentne elektrode
3.0.1.3.1. Kalomelove referentne elektrode
3.0.1.3.2. Srebro/srebro-hloridne elektrode
3.0.1.4. Merenje elektromotorne sile (razlike potencijala) . . .
3.0.1.5. Merenje pH
3.0.1.5.1. Princip merenja pH
3.0.1.5.2. Postupak sa jednostrukom kalibracijom
3.0.1.5.3. Postupak sa dvostrukom kalibracijom
3.0.1.5.4. Standardni rastvori za određivanje pH
3.0.2. Amperometrija
Eksperiment 3.3.1.
Određivanje kompenzacione tačke ugljen-dioksida (C02) merenjem pH
Eksperiment 3.3.2.
Registrovanje ćelijskih potencijala
Eksperiment 3.3.3.
Ispitivanje intenziteta fotosinteze i disanja
Eksperiment 3.3.4.
Ispitivanje dejstva inhibitora na brzinu disanja ćelija kvasca ….
Eksperiment 3.3.5.
Određivanje sadržaja SH-grupa amperometrijskom titracijom . . .

4.         RADIOIZOTOPSKE METODE

4.1.      Prirodna radioaktivnost
4.1.1.   Struktura atoma
4.1.2.   Stabilnost izotopa i radijacija
4.1.3.   Energija radioaktivnog raspada
4.1.4.   Brzina radioaktivnog raspada
4.1.5.   Jedinice radioaktivnosti
4.1.6.   Registrovanje radioaktivnosti
4.1.7.   Apsolutno i relativno merenje raspada
4.2.      Primena radioizotopa
4.2.1.   Ispitivanja puteva metabolizma
4.2.2.   Usvajanje i prenošenje materije
4.2.3.   Primena izotopa u kliničkim istraživanjima
4.2.4.   Korišćenje izotopa u farmakologiji
4.2.5.   Određivanje uzrasta merenjem radioaktivnosti
4.2.6.   Korišćenje izotopa u ekološkim istraživanjima
Eksperiment 4.3.1.
Definisanje karakteristika Gajger-Milerovog brojača
Ekspenment 4.3.2.
Određivanje vremena poluraspada   K na osnovu apsolutnog merenja radioaktivnosti

5.         MANOMETRIJSKE METODE

5.0.      Teoretske osnove
5.0.1. Tipovi manometrije
5.0.1.1. Manometrija pri konstantnoj zapremini
5.0.1.2. Manometrija pri konstantnom pritisku
5.0.1.3. Diferencijalna manometrija
5.1.      Aparatura za manometriju
5.1.1.   Varburgov manometar
5.1.1.1. Kratak opis konstrukcije Varburgovog aparata
5.1.2.   Džilsonov diferencijalni respirometar
5.1.3.   Primena manometrijskih metoda
Eksperiment 5.3.1.
Određivanje intenziteta fotosinteze i disanja manometrijskom metodom
Eksperiment 5.3.2.
Odrečtivanje kiseoničnog kapaciteta krvi i hemolimfe
Literatura

Registar pojmova

1. Metode razdvajanja

1.1. Hromatografske metode

Hromatografske metode spadaju u red najselektivnijih analitičkih i preparativnih metoda razdvajanja. Razvojem sistema za detekciju razdvojenih komponenata, posebno u kombinaciji sa drugim instrumentalnim metodama (spektrofotometrija, masena spektrometrija itd.) dospele su u sam vrh analitičkih metoda i po svojoj osetljivosti. Ovim metodama se mogu razdvojiti supstance čije se molekulske mase kreću u veoma širokom rasponu od najnižih (npr. molekuli vodonika) do najviših (npr. amiloze i amilopektina).

Iako se u literaturi pominje više autora kao začetnika hromatografije, prvi koji je primenio hromatografiju, i u velikoj meri je razvio, bio je ruski botaničar Mihail Semenovič Cvet. On je još 1903. godine razdvajao pigmente hloroplasta iz petrol-etarskog ekstrakta primenjujući elucionu metodu na koloni (stubu) formiranoj u staklenoj cevi od praškastog kalcijum-karbonata. Zbog krajnjih efekata razdvajanja koji su se ogledali u dobijenim odvojenim obojenim zonama pigmenata hloroplasta (karotenoida i hlorofila) ova metoda je dobila naziv hromatografija (grč. hromosboja, grafos-crtati). M.S.Cvet je u svojim obimnim istraživanjima ispitao preko stotinu različitih punjenja kolone i efekte upotrebe različitih rastvarača tako da je, osim za uvođenje hromatografije u analitičku praksu, zaslužan i za razvoj adsorpcionog vida hromatografije odnosno kolonske tehnike hromatografije. Takođe je značajno napomenuti da je M.S.Cvet pretpostavio da se ovom metodom mogu razdvajati i neobojene supstance, što je danas najčešći slučaj.

Kao što se dešava sa svim rezultatima istraživanja koja su ispred svog vremena, tako i istraživanja M.S. Cveta nisu našli primenu sve dok neke nauke, posebno u oblasti biohemije, nisu dostigle potreban stepen razvoja. Zbog toga do nastavka razvoja hromatografije dolazi tek oko 30 godina kasnije (1931), a prva teorijska razmatranja procesa u hromatografiji kasne oko 40 godina.

Razvoj hromatografije uzrokovan je pre svega potrebama biohemije, fiziologije, hemijske i prehrambene tehnologije i teče do sedamdesetih godina ovog veka. Od tada do danas nema nekih bitnih novina u principima i tehnikama hromatografske analize. Značajno je ipak napomenuti da sva nova rešenja u bilo kojoj oblasti izuzetno brzo nalaze svoje mesto u razvoju hromatografske instrumentacije, čime se doprinosi povećanju selektivnosti, osetljivosti, preciznosti i pouzdanosti hromatografskih tehnika.

Koliki je značaj hromatografije može se uočiti iz toga da se danas nijedna analiza kompleksnog materijala ne može izvesti bez primene hromatografskih metoda analize, kao i činjenice da je čitav niz Nobelovih nagrada za nauku dodeljen autorima hromatografskih tehnika ili autorima koji su u svom radu koristili hromatografske tehnike.

Podela hromatografskih metoda

Hromatografske metode se, prema karakteru mobilne i stacionarne faze, odnosno prema fenomenu dominantnom u procesu razdvajanja mogu podeliti u sledeće vidove:

1. adsorpciona hromatografija fenomen adsorpcije
2. podeona hromatografija fenomen raspodele između dve faze
3. hromatografija na izmenjivačima jona fenomen izmene jona
4. hromatografija na molekulskim sitima fenomen molekulskog sita
5. afinitetna hromatografija fenomen visokospecifičnog afiniteta

Pored podele na vidove (o kojima će kasnije biti reči), hromatografske metode se dele na tehnike:

Osnovna je podela na

• kolonske tehnike
• laminarne tehnike

U kolonskim tehnikama se razdvajanje izvodi na stacionarnoj fazi smeštenoj u kolonu. Krajnji cilj razdvajanja je dobijanje odvojenih zapremina ispunjenih čistim supstancama iz smeše. U ove tehnike spadaju na primer: tečna kolonska hromatografija, VPTH-visokopritisna (visokoefikasna) tečna hromatografija i gasna hromatografija.

U laminarnim tehnikama se razdvajanje izvodi na stacionarnoj fazi raspodeljenoj u tankom sloju na nekoj površini. Ovde je krajnji cilj dobijanje odvojenih površina (mrlja) prekrivenih čistim supstancama. U ove tehnike spadaju hromatografija na hartiji i hromatografija na tankom sloju.

Druga podela na tehnike zasnovana je na tome koja se veličina, vreme ili dužina održava kao parametar razdvajanja (t = const ili L = const).

Bez obzira da li se primenjuju kolonske ili laminarne tehnike, pri hromatografiji pri konstantnom vremenu, hromatogram se izražava kao raspodela koncentracije po dužini (slikal.2.c). Na slici 1.2.a prikazana je kolona na koju je dodata mala zapremina smeše (A + B + C), a na slici 1.2.b je dat izgled kolone nakon izvedenog razdvajanja koje je prekinuto nakon konstantnog vremena t, odnosno kada je mobilna faza prešla put 1,.

Hromatogram (kriva raspodele koncentracija po dužini) sadrži u sebi podatke o kvalitetu i kvantitetu ispitivanih supstanci.

Kvalitativne karakteristike su apscise maksimuma pikova odnosno pređeni putevi supstanci (1A, 1B, lc i lx). One se u ovoj tehnici, radi opštijeg značenja i mogućnosti upoređivanja, izražavaju kao relativne, bezdimenzionalne veličine u odnosu na pređeni put mobilne faze (1, − put fronta) ili neke druge supstance (lx). Kvalitativne veličine se označavaju sa Rf (R od “ratio” − odnos, f od front) i Rx.