Mikrobiološke metode analiza hrane su od posebnog značaja u oblasti ispitivanja kvaliteta namirnica. Značaj mikrobioloških analiza hrane ima dva aspekta. Jedan se ogleda u ispitivanjima mikroorganizama koji se koriste u proizvodnji hrane, a drugi u izolaciji i identifikaciji mikroorganizama koji mogu izazvati kvarenje namirnica, a pogotovo onih koji izazvaju oboljenja ljudi i životinja.

S obzirom na sve veći značaj, koji se pridaje bezbednosti proizvodnje, prerade i prometa hrane, prepoznata je potreba da se u nastavni program Osnovnih akademskih studija Prehrambene tehnologije uvede novi predmet pod nazivom Mikrobiološke metode analiza hrane, što je i realizovano kroz Akreditaciju nastave Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Takođe u Programima master, specijalističkih i doktorskih studija Prehrambene tehnologije zastupljeni su predmeti, koji se u velikom delu oslanjaju na predmet Osnovnih studija Mikrobiološke metode analiza hrane. Zbog toga je ovaj praktikum namenjen pre svega studentima osnovnih studija Prehrambene tehnologije, a kao polazna literatura namenjen je i studentima viših nivoa studija Prehrambene tehnologije.

Koncept ovog praktikuma je realizovan tako da se nakon opšteg dela o uslovima gajenja mikroorganizama i metoda izdvajanja čistih kultura i određivanja ukupnog broja mikroorganizama, posebna pažnja posvećuje metodama izolacije i karakterizacije mikroorganizama koji se koriste kao starter kulture u industriji hrane i metodama izolacije i identifikacije mikroorganizmima koji izazivaju kvarenje i kontaminaciju hrane. U praktikumu su obrađene osnovne metode mikrobiološke analize namirnica kao postupci klasičnih metoda izolacije i identifikacije mikroorganizama. Praktikum je koncipiran tako da vežbe prate nastavni plan predmeta, a da je izvođenje vežbi realno u okviru predviđenog fonda časova.

U praktikumu nisu date imunološke metode, savremene brze metode, kao ni genetske metode identifikacije mikroorganizama, što bi prevazilazilo domen predmeta na Osnovnim studijama, a zadiralo u programe predmeta viših nivoa studija.

Autori
doc. dr Zorica Radulović i dipl. ing. Milica Petrušić

Sadržaj

Upustvo za rad u mikrobiološkoj laboratoriji i vežbaonici

1. USLOVI ZA GAJENJE MIKROORGANIZAMA

1.1. Sterilizacija
1.1.1. Fizička sterilizacija-toplotom
1.1.1.1. Suva sterilizacij a
1.1.1.2. Sterilizacija vodenom parom
1.1.2. Mehanička sterilizacija − filtriranjem
1.1.3. Sterilizacija zračenjem
1.2. Ilranljive podloge
1.2.1. Vrste hranljivih podloga
1.2.2. Pripremanje hranljivih podloga
1.2.2.1. Priprema hranljivih podloga i sterilizacija
1.3. Gajenje aerobnih i anaerobnih mikroorganizama
1.3.1. Aparati za gajenje aerobnih mikroorganizama
1.3.2. Uređaji za gajenje anaerobnih mikroorganizama
1.4. Zasejavanje hranljivih podloga
1.4.1. Zasejavanje tečnih podloga
1.4.2. Zasejavanje čvrstih podloga

2. METODE ZA IZDVAJANJE ČISTIH KULTURA MIKROORGANIZAMA

2.1. Izdvajanje čistih kultura metodom razređivanja
2.2. Izdvajanje čistih kultura metodom iscrpljivanja

3. METODE ODREĐIVANJA UKUPNOG BROJA MIKROORGANIZAMA

3.1. Direktna metoda − metoda po Brecd-u
3.2. Indiretna metoda − metoda po Koch-u

4. METODE IZOLACIJE IIDENTIFIKACIJE BAKTERIJA MLEČNE KISELINE

4.1. Karakteristike rodova bakterija mlečne kiseline
4.1.1. Lactococcus sp.
4.1.2. Leuconostoc sp.
4.1.3. Lactobacillus sp.
4.1.4. Streptococcus sp.
4.1.5. Pediococcus sp.
4.1.6. Bifidobacterium sp.
4.2. Čuvanje bakterija mlečne kiseline
4.3. Izolacija bakterija mlečne kiseline
4.4. Identifikacija bakterija mlečne kiseline
4.4.1. Provera čistoće kulture u utvrđivanje oblika bakterija
4.4.2. Katalaza test
4.4.3. Način fermentacije šećera
4.4.4. Ispitivanje acidogene sposobnosti
4.4.5. Rast na agaru sa CaCl2
4.4.6. Proteolitička aktivnost bakterija mlečne kiseline
4.4.7. Rast bakterija mlečne kiseline na mlečnom agaru
4.4.8. Rezistentnost bakterija mlečne kiseline na antibiotike
4.4.9. Difuzna metoda za antibiogram test
4.5. Identifikacija bakterija inlečne kiseline poinoću API sistema

5. METODE IZOLACIJE IIDENTIFIKACIJE KVASACA

5.1. Oksidativni kvasci
5.2. Oksidativno − fermentativni kvasci
5.3. Fermentativni kvasci
5.4. Izolacija kvasaca
5.5. Identifikacija kvasaca
5.5.1. Mikroskopske i makroskopske morfološke osobine kvasaca
5.5.2. Ispitivanje sposobosti stvaranja pseudomicelijuma
5.5.3. Ispitivanje fermentativnosti/oksidativnosti kvasaca proba vrenja
5.5.4. Ispitivanje stvaranja askusai askospora
5.6. Identifikacija kvasaca pomoću API sistema

6. METODE IZOLACIJE IIDENTIFIKACIJE GLJIVA

6.1. Niže gljive
6.1.1. Mucor sp.
6.1.2. Rhizopus sp.
6.2. Više gljive
6.2.1. Aspergillus sp.
6.2.2. Penicillium sp.
6.2.3. Fungi imperfecti
6.3. Izolovanje i idcntifikacija gljiva
6.3.1. Kriterijumi za identifikaciju gljiva
6.3.2. Mikroskopska ispitivanja

7. METODE IZOLACIJE IIDENTIFIKACIJE BAKTERIJ/ KOJE IZAZIVAJU KVARENJE HRANE

7.1. Psihrotrofne bakterije
7.1.1. Psihrotrofne aerobne bakterije
7.1.2. Psihtrotrofne fakultativno anaerobne bakterije
7.1.3. Psihrotrofne termorezistntne bakterije
7.2. Terniofilne bakterije
7.3. Acidogene bakterije
7.4. Određivanje mikroorganizania koje izazivaju kvarenje
7.4.1. Određivanje ukupnog broja aerobnih bakterija
7.4.2. Određivanje psihtrotrofnih aerobnih bakterija
7.4.3. Određivanje psihrotrofnih fakultativno anaerobnil’ bakterija
7.4.4. Određivanje termorezistentnih bakterija
7.4.5. Određivanje ukupnog broja sporogenih aerobnih bakterija
7.4.6. Određivanje ukupnog broja kvasaca i plesni
7.4.7. Određivanje prisustva acidogenih bakterija

8. METODE IZOLACIJE IIDENTIFIKCIJE BAKTERIJ4 KONTAMINENATA ŽIVOTNIH NAMIRNICA

8.1. Salmonella sp.
8.1.1 .Izolovanje i identifikacija Salmonela
8.2. Staphylococcus sp.
8.2.1. Izolovanje i identifikacija koagulaza pozitivnih stafilokoka
8.3. Clostridium sp.
8.3.1. Izolovanje i identifikacija sulfitoredukujućih Klostridija
8.4. Escherichia coH
8.4.1. Izolovanje i identifikacijaif. coli
8.5. Enterobacteriaceae
8.5.1. Izoiacija i identifikacija Enterobacteriaceae
8.5.2. Biohemijsko potvrđivanje
8.6. Listeria monocytogenes
8.6.1. Izolovanjei identifikacija L. nmmocytogenes
8.6.1.1. Potvrdne metode 8.6.2.0dređivanje brojaZ. monocytogenes
8.6.2.1. Proračun rezultata
8.6.2.2. Proračun malih brojeva

9. PRILOG

10. LITERATURA

Upustvo za rad u mikrobiološkoj laboratoriji i vežbaonici

Radi lične zaštite, zaštite imovine i izvršenja zadataka iz praktične nastave, potrebno je da se studenti pridržavaju određenih pravila pri radu u mikrobiološkoj laboratoriji i vežbaonici.

1. Pre ulaska u laboratoriju ili vežbaonicu nepotrebne predmete odložiti u odgovarajući ormar ili prostoriju.
2. Ulaz u laboratoriju i mikrobiološku vežbaonicu dozvoljen je samo radnom osoblju i studentima koji izvode vežbanja. U laboratoriju treba ući čist i u čistom belom mantilu.
3. Radno mesto mora biti besprekomo čisto i uredno. Radni sto pre početka i posle završenog rada prebrisati dezinfekcionim sredstvom.
4. Zabranjeno je unositi hranu u vežbaonicu (laboratoriju), jesti, piti ili pušiti. Voda se takođe ne sme piti iz laboratorijskih čaša i drugog laboratorijskog posuđa. Nikakve nesterilne predmete ne treba stavljati u usta za vreme rada u laboratoriji.
5. Po stolovima ne ostavljati nečisto staklo, pribor (učila), vatu, vatene zapušače, papir, nepotrebne i otvorene kulture mikroorganizama i dr. Sav otpadni materijal stavljati u posude ili korpe za otpatke. Pri tome kontaminirani materijal i predmeti s mikroorganizmima odbacivati u posebne sudove s dezinfekcionim sredstvom. U stolovima na isti način održavati potreban red i čistoću.
6. Stakleni pribor sa upotrebljenim i neupotrebljenim kulturama mikroorganizama pre pranja staviti u žičane korpe i obavezno sterilisati u autoklavu.
7. Upotrebljene pipete, pločice, ljuspice i dr. stavljati u posebne sudove sa dezinfekcionim sredstvom.
8. Pri radu sa mikroorganizmima, bilo da su patogeni ili ne, treba se uvek čuvati od infekcije. Izbegavati dodir rukama, nos, oči i usta. Ukoliko se nepažnjom desi da materijal s mikroorganizmima pri radu dospe u usta, odmah treba izvršiti dezinfekciju usta odgovarajućim dezinfekcionim sredstvom. U slučaju povrede pri radu, odmah se prijaviti asistentu.
9. Zaprljana mesta, kao i mesta na kojima je prosuta kultura mikroorganizama, treba preliti dezinfekcionim sredstvom ili 70% alkoholom.
10. Pre i posle uzimanja kulture mikroorganizama, bakteriološke igle i petlje treba sterilisati na plamenu špiritusne lampe (opaliti). U slučaju da se petljom ili iglom zahvata materijal koji je sluzast, viskozan i sl., petlju s materijalom treba osušiti pre sterilizacije na plamenu, jer u suprotnom, može doći do rasprskavanja i rasejavanja materijala, odnosno živih mikroorganizama.
11. Hranljive podloge, hemikalije, mikrobiološke kulture, pribor i aparati treba da budu uredno složeni i da imaju svoja određena mesta u laboratoriji.
12. Pri radu treba štedeti hemikalije, hranljive podloge, pribor i aparate. Nije dozvoljeno da nepotrebno svetle električne lampe, gore špiritusne lampe i boce na butan-gas, teče voda i sl. Posebnu pažnju treba obratiti pri mkovanju s butanbocama i autoklavom. Butan-boce moraju biti uvek dobro zatvorene, a autoklav se nikad ne sme otvarati dok je pod pritiskom vodene pare.
13. Praktičan rad treba obavljati sistematski i povezivati ga sa teorijskom nastavom. Ukoliko kod studenata postoji interes za produbljivanjem znanja iz mikrobiologije, slobodno vreme treba da koristi za čitanje mikrobiološke literaure i rad u laboratoriji.
14. Svaku izvedenu vežbu student unosi u svesku (praktikum) i u priloge upustva za rad pregledno i jasno. Iz unetih podataka potrebno je da se vidi naziv vežbe, datum vežbanja, svrha vežbanja, potreban materijal i pribor, izvedeni postupak, dobijeni rezultati po mogućstvu iskazani u tabeli. Mikroorganizme odgovarajućeg oblika i veličine jednostavno skicirati grafitnom olovkom ili drvenom bojom.
15. Poželjno je da student unosi u svoju beležnicu i sopstvena zapažanja do kojih je došao u toku praktičnog rada.
16. Za svaku narednu vežbu mora biti pripremljen potreban materijal i pribor (kulture, mikroorganizme, hranljive podloge, stakleni pribor i dr.). Student treba da prouči vežbu pre nego što pristupi njenom izvođenju. Svrha i način izvođenja vežbe moraju biti potpuno jasni.
17. Posle završenog praktičnog rada u laboratoriji, student sređuje svoje radno mesto. Pribor, kojim je radio, postavlja na svoje mesto. Zatim proverava da li je radno mesto čisto, isključen dovod gasa, isključena struja i zaustavljena voda. Na kraju izvršiti dezinfekciju ruku, a zatim ih temeljno oprati sapunom i vodom.

Uputstvo za rad u mikrobiološkoj laboratoriji i vežbaonici

Radi lične zaštite, zaštite imovine i izvršenja zadataka iz praktične nastave, potrebno je da se studenti pridržavaju određenih pravila pri radu u mikrobiološkoj laboratoriji i vežbaonici.

1. Pre ulaska u laboratoriju ili vežbaonicu nepotrebne predmete odložiti u odgovarajući ormar ili prostoriju.
2. Ulaz u laboratoriju i mikrobiološku vežbaonicu dozvoljen je samo radnom osoblju i studentima koji izvode vežbanja. U laboratoriju treba ući čist i u čistom belom mantilu.
3. Radno mesto mora biti besprekorno čisto i uredno. Radni sto pre početka i posle završenog rada prebrisati dezinfekcionim sredstvom.
4. Zabranjeno je unositi hranu u vežbaonicu (laboratoriju), jesti, piti ili pušiti. Voda se takođe ne sme piti iz laboratorijskih čaša i dmgog laboratorijskog posuđa. Nikakve nesterilne predmete ne treba stavljati u usta za vreme rada u laboratoriji.
5. Po stolovima ne ostavljati nečisto staklo, pribor (učila), vatu, vatene zapušače, papir, nepotrebne i otvorene kulture mikroorganizama i dr. Sav otpadni materijal stavljati u posude ili korpe za otpatke. Pri tome kontaminirani materijal i predmeti s mikroorganizmima odbacivati u posebne sudove s dezinfekcionim sredstvom. U stolovima na isti način održavati potreban red i čistoću.
6. Stakleni pribor sa upotrebljenim i neupotrebljenim kulturama mikroorganizama pre pranja staviti u žičane korpe i obavezno sterilisati u autoklavu.
7. Upotrebljene pipete, pločice, ljuspice i dr. stavljati u posebne sudove sa dezinfekcionim sredstvom.
8. Pri radu sa mikroorganizmima, bilo da su patogeni ili ne, treba se uvek čuvati od infekcije. Izbegavati dodir rukama, nos, oči i usta. Ukoliko se nepažnjom desi da materijal s mikroorganizmima pri radu dospe u usta, odmah treba izvršiti dezinfekciju usta odgovarajućim dezinfekcionim sredstvom. U slučaju povrede pri radu, odmah se prijaviti asistentu.
9. Zaprljana mesta, kao i mesta na kojima je prosuta kultura mikroorganizama, treba preliti dezinfekcionim sredstvom ili 70% alkoholom.
10. Pre i posle uzimanja kulture mikroorganizama, bakteriološke igle i petlje treba sterilisati na plamenu špiritusne lampe (opaliti). U slučaju da se petljom ili iglom zahvata materijal koji je sluzast, viskozan i sl., petlju s materijalom treba osušiti pre sterilizacije na plamenu, jer u suprotnom, može doći do rasprskavanja i rasejavanja materijala, odnosno živih mikroorganizama.
11. Hranljive podloge, hemikalije, mikrobiološke kulture, pribor i aparati treba da budu uredno složeni i da imaju svoja određena mesta u laboratoriji.
12. Pri radu treba štedeti hemikalije, hranljive podloge, pribor i aparate. Nije dozvoljeno da nepotrebno svetle električne lampe, gore špiritusne lampe i boce na butan-gas, teče voda i sl. Posebnu pažnju treba obratiti pri rukovanju s butan bocama i autoklavom. Butan-boce moraju biti uvek dobro zatvorene, a autoklav se nikad ne sme otvarati dok je pod pritiskom vodene pare.
13. Praktičan rad treba obavljati sistematski i povezivati ga sa teorijskom nastavom. Ukoliko kod studenata postoji interes za produbljivanjem znanja iz mikrobiologije, slobodno vreme treba da koristi za čitanje mikrobiološke literature i rad u laboratoriji.
14. Svaku izvedenu vežbu student unosi u svesku (praktikum) i u priloge uputstva za rad pregledno i jasno. Iz unetih podataka potrebno je da se vidi naziv vežbe, datum vežbanja, svrha vežbanja, potreban materijal i pribor, izvedeni postupak, dobijeni rezultati po mogućstvu iskazani u tabeli. Mikroorganizme odgovarajućeg oblika i veličine jednostavno skicirati grafitnom olovkom ili drvenom bojom.
15. Poželjno je da student unosi u svoju beležnicu i sopstvena zapažanja do kojih je došao u toku praktičnog rada.
16. Za svaku narednu vežbu mora biti pripremljen potreban materijal i pribor (kulture, mikroorganizme, hranljive podloge, stakleni pribor i dr.). Student treba da prouči vežbu pre nego što pristupi njenom izvođenju. Svrha i način izvođenja vežbe moraju biti potpuno jasni.
17. Posle završenog praktičnog rada u laboratoriji, student sređuje svoje radno mesto. Pribor, kojim je radio, postavlja na svoje mesto. Zatim proverava da li je radno mesto čisto, isključen dovod gasa, isključena struja i zaustavljena voda. Na kraju izvršiti dezinfekciju ruku, a zatim ih temeljno oprati sapunom i vodom.

1. Uslovi za gajenje mikroorganizama

Rad u mikrobiološkoj laboratoriji podrazumeva izučavanje mikroorganizama, a jedan od osnovnih preduslova za uspešnost u radu je manipulacija čistim kulturama. Za gajenje i ispitivanje čistih kultura neophodno je obezbediti sterilnu sredinu odnosno, neophodno je eliminisati sve mikroorganizme iz podloge, laboratorijskih sudova i okruženja, kako ne bi došlo do kontaminacije čistih kultura stranim mikroorganizmima. Kontaminacija čiste kulture može da potiče od vazduha, ali češće usled dodira sa ne sterilnim priborom. Da bi se čiste kulture zaštitile od nepoželjnih mikroorganizama, primenjuje se sterilizacija.

1.1.Sterilizacija

Sterilizacija je postupak potpunog uništavanja svih mikroorganizama u određenoj sredini. Postoji više tipova sterilizacije: fizička sterilizacija − toplotom, mehanička sterilizacija − filtriranjem, zračna sterilizacija − primenom različitih zraka, hemijska sterilizacija − primenom hemijskih sredstava.

1.1.1. Fizička sterilizacija − toplotom

Primena visokih temperatura ima letalni efekat za sve mikroorganizme. Parametri koji opredeljuju letalni efekat su visina temperature i dužina njenog trajanja.

1.1.1.1. Suva sterilizacija

Sterilizacija u suvom sterilizatoru: najčešće se primenjuje za staklene sudove − erlenmajere, Petri šolje i pipete. Temperaturni režim za ovu sterilizaciju je 160-180°C za vreme od 1-2 sata u suvom sterilizatoru-sušnici. Vreme sterilizacije se računa od momenta kada je postignuta navedena temperatura. Po završenoj sterilizaciji treba ostaviti strerilizator da se postepeno ohladi do sobne temperature.

Naglo hlađenje pri otvaranju sterilizatora na visokoj temperaturi može da izazove prskanje staklenih sudova. Sterilizacija u plamenu (flambiranje): koristi se za sterilizaciju eze, pincete, kašičice, špatule i ostalog sitnog pribora. Prilikoin žarenja eze u plamenu, vrh eze se prvo unosi u redukcioni plamen koji je hladniji, gde se materijal najpre suši, pa se eza postepeno podiže u oksidacionu zonu radi sterilizacije.

1.1.1.2. Sterilizacija vodenom parom

Ovaj postupak je veoma efikasan, jer se postiže uništavanje svih mikroorganizama, uključujući i spore. Proces se odvija pod pritiskom od 1-1,2 atm, što odgovara temperaturi od 110130°C za vreme od 10-30 minuta. Visina temperature i vreme sterilizacije zavise od vrste i količine materijala koji se steriliše.

Ovim postupkom se steriliše največi broj hranljivih podloga, koje podnose više temperature, kao i za sterilizaciju sudova i instrumenata. Sterilizacija se odvija u u autoklavima pod pritiskom. Za pravilnu sterilizaciju neophodno je dobro poznavanje aparata i rukovanje njim.

Autoklav je aparat koji ima duple zidove i hermetičko zatvaranje. Sa spoljne strane se nalazi otvor za punjenje destilovanom vodom, u unutrašnjem delu autoklava pri dnu između dvostrukih zidova nalazi se prostor za vodu u kome su smešteni grejači. Prostor za vodu je povezan sa vodomerom koja nam pokazuje nivo vode u autoklavu. Vodena para koja nastaje u spoljašnjem delu ulazi kroz uzani otvor u prostor za sterilizaciju koji je povezan sa termometrom, manometrom i ventilom sigurnosti (Prilog slika 1).

Posle sterilizacije u autoklavu aparat treba ostaviti da se postepeno ohladi i padne pritisak. Otvaranje autoklava pod pritiskom može da izazove opekotine, izbacivanje zapušača i dr.

Rukovanje autoklavom:

1. Svi ventili na autoklavu treba da budu otvoreni
2. Sipati destilovanu vodu i levkasti otvor, nivo vode na vodomernom staklu treba da bude u plavoj zoni
3. Staviti materijal za sterilizaciju u autoklav, poklopac zatvoriti, zavrtnje zavrnuti.
4. Uključiti glavni prekidač za struju.
5. Po zagrevanju (približno 15-20 minuta) iz levkastog ventila počinje da izbija para, što je znak da je istisnut vazduh iz prostora za sterilizaciju, ventile zatvoriti i na manometru sa leve strane može da se prati kako se polako podiže pritisak u unutrašnjem sudu.
6. Kada se dostigne pritisak od 0.1 MPa, sklopka automatski počinje da isključuje i uključuje struju.
7. Otvoriti malo ventil za ispuštanje da bi se pratilo postizanje temperature.
8. Kada je temperatura 121°C računati vreme sterilizacije 20min.
9. Posle isteka vremena sterilizacije isključiti glavni prekidač i malo otvoriti ventil za ventilaciju.
10. Autoklav ostaviti da se postepeno hladi pri čemu dolazi do sniženja temperature i smanjenja pritiska.
11.  Kada pritisak padne skoro na nulu, otvoriti potpuno ventilacioni ventil.
12. Otvoriti poklopac autoklava pazeći da ne dođe do opekotina vrelom parom.

Kontrola sterilizacije je postupak koji treba primenjivati pri sterilizaciji u autoklavu. Zajedno sa priborom u autoklav se stavljaju i posebni termoindikatori, koji menjaju boju na određenoj temperaturi. Najekonomičnije je primena indikator trake koja se lepi na pribor koji se steriliše. Pojava tamnih obojenja na traci je znak da je temperatura sterilizacije postignuta.

1.1.2. Mehanička sterilizacija − filtriranjem

Ovaj postupak sterilizacije se primenjuje za rastvore koji pod uticajem toplote mogu da pretrpe fizičke i hemijske promene (sa termolabilnim supstancama: vitaminima, antibioticima, šećerima). Tečnost koja se steriliše propušta se kroz filter na kome se zadržavaju mikroorganizmi, a kroz filter se propušta sterilan rastvor. Upotrebljavaju se najčešće membran filtri (acetatna celuloza, nitroceluloza) sa različitom veličinom pora, najčešće 0.45 ili 0.2 µm (npr. Satrotius ili Millipor). Filtracija se odvija pod smanjeniin pritiskom pomoću vodene ili uljane vakum pumpe. Za male zapremine rastvora mogu se koristiti i sterilni filtri kao dodaci špricevima.

1.1.3. Sterilizacija zračenjem

Ultravioletni (UV) zraci obuhvataju spektralno područje od 10-380 nmi. Zavisno od talasne dužine ovi zraci deluju više ili manje letalno, a najizrazitije dejstvo pokazuju UV zraci sa talasnom dužinom od 265 nm, pa se za sterilizaciju upotrebljavaju UV lampe koje emituju svetlost na ovoj talasnoj dužini. Zbog baktericidnog dejstva UV zraci se primenjuju za sterilizaciju vazduha, laboratorijskih povišina i laboratorijskog prostora. U mikrobiološkim laboratorijama se koriste posebne laminarne komore sa UV lampom. (Prilog slika 2). UV zraci imaju malu prodornost, pa im je primena ograničena na dezinfekciju izloženih površina ili okolnog vazduha.

X-zraci i y-zraci su po prirodi veoma prodorni i deluju uglavnom mikrobicidno. Jonizujuće zračenje proizvodi elektrone, hidroksil radikale, hidrid radikale, reaktivne molekule koji mogu da degradiraju ili izmene DNA ili proteine i time izazovu smrt ozračene ćelije.

Kao izvori y zračenja se najčešće upotrebljavaju radioizotopi 60Co i 137Cs. Upotrebljavaju se za sterilizaciju špriceva, hirurške opreme i dr. Zbog štetnosti po zdravlje i cena opreme, ova vrsta sterilizacije je ograničena na velike industrijske sisteme i specijalizovana postrojenja.

1.2. Hranljive podloge

Hranljive podloge treba da sadrže sve supstance neophodne za rast određenog mikroorganizma. Te supstance su najčešće neorganska ili organska jedinjenja koja predstavljaju izvor energije, elektrona, ugljenika i azota. Hranljiva podloga treba da bude i dobar izvor makroelemenata (kiseonik, vodonik, fosfor, sumpor, gvožđe, kalijum, natrijum, magnezijum) i mikroelemenata, kao što su mangan, cink, bakar, molibden, kobalt i dr. Takođe, svaka hranljiva podloga mora da sadrži dovoljne količine vode, da ima odgovarajući kiselost (pH), koja je optimalna za razviće date vrste, da je sterilna, kako bi se obezbedilo nesmetano razviće gajenih mikroorganizama.

1.2.1. Vrste hranljivih podloga

Za gajenje mikroorganizama primenjuje se veliki broj raznovrsnih podloga, koje se mogu podeliti na nekoliko načina: prema konzistenciji podloge su tečne (bujoni, mleko i dr.) i čvrste (agari); prema poreklu podloge mogu biti prirodne (biljnog ili animalnog porekla) i sintetičke (organske, neorganske). Prema nameni podloge mogu biti :

• osnovne ili opšte, koje su po svoin sastavu takve da omogućuju gajenje većeg broja grupa i vrste mikroorganizama. Osnovne podioge za gajenje bakterija su hranljivi bujon i agar, za gajenje kvasaca sladni bujon, sladni agar i za gajenje plesni Čapekov agar);
• specijalne, koje služe za gajenje tačno određene vrste mikroorganizama;
• selektivne, koje omogućuju rast određenoj grupi mikroorganizama, a inhibiraju razvoj drugih vrsta (Prilog slika 3, 4);
• diferencijalne, koje se koriste za razlikovanje kolonija jedne vrste od kolonija drugih vrsta mikroorganizama. Sadrže indikator (fenol red, eozin, metil blue i dr.), koji omogućava razlikovanje kolonija na osnovu hemijskili reakcija koje se dešavaju tokom rasta mo. Vizuelno se kolonije razlikuju pojavom kolonija različitih boja (Prilog slika 5).

1.2.2. Pripremanje hranljivih podloga

Podloge se pripremaju odmeravanjem neophodnih komponenti podloge, rastvaranjem u vodi (sa ili bez zagrevanja), razlivanjem u odgovarajuće posude i njenom sterilizacijom. Danas se najviše koriste dehidratisane gotove hranljive podloge definisanog sastava, koji je dat na samom pakovanju podloge. Gotove hranljive podloge se pripremaju većina jednostavno, prema uputstvu koje je dao proizvođač same podloge. Za većinu podloga potrebno je proveriti pH vrednost podloge i po potrebi je dovesti do preporučene vrednosti, koja je takođe data od strane proizvođača. Podešavanje pH vrednosti se vrši dodavanjem 1N rastvora kalijum ili natrijum − hidroksida (NaOH), odnosno ako treba povećati kiselost, dodaje se 1N rastvor lilorovodonične kiseline (HCl).

Tečne hranljive podloge se nalivaju u epruvete ili erlenmajere. Koriste se «bacto» epruvete dimenzija 16×160 mm u koje se sipa po 5 do 10 ml, a u erlemnajere najviše 1/3 zapremine. Čvrste hranljive podloge se razlivaju rastopljene, dok su još tople i u tečnom stanju, i to u epruvete u količini od 10 ml za „dubok agar“ i 5 do 7 ml za „kosi agar“. Posle sterilizacije epruvete za duboki agar se drže uspravno dok se ne ohlade. Epruvete sa kosim agarom se posle sterilizacije postavljaju u kosi položaj i sačeka se da se u tom položaju stegnu. Kosa površina agara služi za zasejavanje mikroorganizama. Razlivanje u Petri kutije podrazumeva razlivanje podloga koje su sterilisane u erlenmajeru, a u Petri kutije se razlivaju prilikom zasejavanja u sterilnoj zoni plamenika ili laminamoj komori.