Mikrobne kulture u proizvodnji mliječnih proizvoda

Mljekarska industrija u našoj zemlji u posljednjih 20 godina zabilježila je značajan razvoj u pogledu kakvoće, količine i vrste mliječnih proizvoda. On je postignut ne samo uz pomoć šire društvene zajednice, već i samoprijegornim radom mljekarskih stručnjaka. Daljnji razvoj mljekarske industrije omogućiti će, uz ostale preduvjete, i bogatiji izbor stručno-znanstvene literature s područja mljekarstva u našoj zemlji, namijenjene usavršavanju mljekarskih kadrova. Autorica i izdavač se nadaju da će ovo djelo poslužiti diplomiranim inženjerima i stručnjacima u proizvodnim pogonima i laboratorijima, a u pojedinim dijelovima i radnicima u mljekarskim institutima. Djelo bi trebalo poslužiti i kao udžbenik za studente tehnologije mlijeka i mliječnih proizvoda.

Proizvodnja i prerada mlijeka veoma je široka oblast znanstvenog i stručnog istraživanja. Razvojem pojedinih grana proizvodnje razvija se znanstveni i stručni prilaz problematici, odvajaju se posebne grane istraživanja, a u tehnologiji posebne linije za preradu. Tehnologija sireva i tehnologija fermentiranih mliječnih napitaka zauzimaju veoma značajno mjesto u preradi mlijeka u svijetu, a i u našoj zemlji.

Vrijednost fermentiranih mliječnih napitaka i sireva dokazana je ne samo njihovom veoma dobrom prihvatljivošću kod potrošača, već i njihovom nesumnjivo povećanom trajnošću u odnosu na mlijeko; fermentirani mliječni napici bolje su probavljivi i imaju veću biološku i zdravstvenu vrijednost. Stoga ne čudi da se danas u svijetu proizvodi veoma veliki broj fermentiranih mliječnih napitaka i oko 500 vrsta sireva.

U tehnologiji sira i fermentiranih mliječnih napitaka veoma važnu ulogu zauzimaju mljekarske mikrobne kulture, tj. starter kulture (starteri). Razvivši se u mlijeku ili siru, one utječu ne samo na svojstva proizvoda već i na razlike između pojedinih vrsta fermentiranih proizvoda.

Pravilan izbor mljekarske kulture i njezina kakvoća utječu na uspješnost proizvodnje osobito fermentiranih mliječnih napitaka i nesumnjivo utječe na ekonomske učinke proizvodnje u mljekarama. U našoj se zemlji velika količina mlijeka namijenjenog preradi prerađuje u fermentirane mliječne napitke i u sireve. Na području SR Hrvatske tijekom 1988. godine proizvedeno je 16.965.000 kg sira i 47.268.000 litara fermentiranih mliječnih napitaka od ukupno 505.381.000 iitara mlijeka prerađivanog u različite mliječne proizvode. Sasvim je jasno da svaka neuspješna proizvodnja predstavlja značajan ekonomski gubitak za proizvođača. Stoga valja pripaziti na svaki dio tehnološkog procesa u kojem sudjeluje i mljekarska kultura-starter, sa svim svojim specifičnostima.

Važnost mljekarskih mikrobnih kultura za mljekarsku praksu (proizvodnu i obrazovnu) i saznanje da na području Jugoslavije nema rada koji bi obuhvatio većinu saznanja o primjeni i proizvodnji mljekarskih kultura, doprinijeli su odluci da se napiše ovo djelo.

Djelo je podijeljeno u više poglavlja. U prvom poglavlju prikazana je klasifikacija mljekarskih kultura. U trećem poglavlju djela obrađeni su taksonomija, metabolizam i rast bakterija važnih za proizvodnju fermentiranih mliječnih napitaka i sireva. Poglavlje koje obuhvaća mljekarske kulture za proizvodnju fermentiranih mliječnih napitaka obrađuje, uz bakterije mliječne kiseline, i ostale mikroorganizme koji se upotrebljavaju u toj proizvodnji. Posebno je obrađen metabolizam ugljikohidrata i bjelančevina u bakterija mliječne kiseline. Istaknuta je uloga mljekarskih kultura u proizvodnji sira, tj. njihova uloga u biokemijskim procesima koji se odvijaju u siru. Opisana su i svojstva nekih poznatijih vrsta sireva i prikazan je sastav starter kultura za njihovu proizvodnju. Istaknuta je uloga mliječnog šećera, mliječne masti i bjelančevina u procesu stvaranja arome sireva, povezana s djelovanjem mikroorganizama.

U djelu je također prikazana moderna tehnologija mljekarskih kultura i iznijeti su načini njihove upotrebe. Posebno je obrađena proizvodnja radnih mljekarskih kultura. Djelo sadržava i standardne metode konirole kakvoće mljekarskih kultura, što je posebno zanimljivo stručnjacima koji rade u proizvodnim pogonima.

Građa na temelju koje je ovo djelo napisano sadržava više stotina navoda iz literature, od kojih je navedena većina i u popisu literature.

Želim na kraju izraziti zahvalnost prof. dr. Marijani Carić, prof. dr. Miroslavi Todorović i mr. Ljubici Tratnik koje nisu žalile truda da pregledaju rukopis djela i svojim sugestijama doprinesu njegovom poboljšanju.

Zagreb, svibanj 1989.

AUTORICA

Sadržaj

I Klasifikacija mljekarskih kultura

II Genetičko inženjerstvo bakterija namijenjenih proizvodnji fermentiranih mliječnih proizvoda

III Taksonomija i metabolizam mikroorganizama važnih za proizvodnju fermentiranih mliječnih proizvoda

1. Kulture za fermentirane mliječne napitke
1.1. Razlike između bakterija mliječne kiseline i srodnih vrsta
1.1.1. Rod Lactobacillus
1.1.2. Rod Streptococcus
1.1.3. Rod Leuconostoc
1.1.4. Rod Pediococcus
1.1.5. Rod Bijidobacterium
1.1.6. Ostali mikroorganizmi u fermentiranim mliječnim napicima i njihova taksonomija
1.1.7. Metabolizam ugljikohidrata u bakterija mliječne kiseline
1.1.8. Metabolizam proteina u bakterija mliječno-kiselog vrenja
1.2. Mezofilne kulture za fermentirane mliječne napitke
1.2.1. Neka posebna i tehnološka svojstva mezofilnih kultura
1.2.2. Faktori koji utječu na rast i aktivnost mezofilnih kultura
1.3. Termofilne kulture za proizvodnju fermentiranih napitaka
1.4. Kulture za proizvodnju kefira i kumisa
1.4.1. Kulture za proizvodnju kefira
1.4.2. Kulture za proizvodnju kumisa
1.4.3. Metabolizam mikroflore kefira i kumisa
1.5. Kulture koje sadržavaju intestinalne bakterije
1.5.1. Vrste kultura
1.5.2. Selekcija i biokemijska svojstva intestinalnih bakterija
1.5.3. Kriteriji za selekciju bakterija namijenjenih proizvodnji dijetetskih mliječnih napitaka
1.5.4. Faktori koju utječu na održavanje kultura
1.5.5. Načini nabave i distribucija kultura, te pregled pripreme kultura sa selekcioniranim intestinalnim bakterijama

2. Kulture za proizvodnju sireva
2.1. Identifikacija bakterija važnih za proizvodnju sireva
2.2. Kulture i njihov utjecaj na mikroorganizme kontaminante u siru
2.3. Primjena kultura u proizvodnji sira
2.4. Karakteristike nekih poznatijih vrsti sireva i sastav kultura za njihovu proizvodnju
2.5. Razvoj arome u sirevima
2.5.1. Uloga ugljikohidrata u tvorbi arome sira
2.5.2. Uloga mliječnih masti u procesu stvaranja arome sira
2.5.3. Uloga proteina u tvorbi arome sira

IV Proizvodnja mljekarskih kultura

1. Način primjene kultura
1.1. Primjena proizvodnih kultura za fermentirane mliječne napitke
1.2. Priprema proizvodnih kultura u sirarstvu
1.3. Važne faze u procesu pripreme proizvodne kulture

V Konirola kvalitete mljekarskih kultura

1. Konirola kvalitete kultura za proizvodnju fermentiranih mliječnih napitaka

2. Konirola kvalitete kultura za proizvodnju sira
2.1. Određivanje broja bakterija koje fermentiraju citrate
2.2. Određivanje količine CO2 u kulturi
2.3. Metode istraživanja prisutnosti bakteriofaga u kulturi i mlijeku za proizvodnju sira

VI 1. Popis važnijih pojmova

2. Literatura

Najstarija poznata metoda koja služi za produženje trajnosti hrane je fermentacija. Tipičan primjer je mliječno-kisela fermentacija koja se upotrebljava u proizvodnji fermentiranih mliječnih proizvoda kao što su sir, fermentirani mliječni napici (jogurt, acidofilno mlijeko, ymer, skyn, fdmjolk, fermentirana stepka, i dr.), fermentirano vrhnje i kiselo-alkoholni mliječni proizvodi kao što su kefir i kumis.

Fermentacija je rezultat prisutnosti mikroorganizama (bakterija, kvasaca, plijesni ili kombinacije ovih mikroorganizama) i njihovih enzima u mlijeku. U mljekarskoj industriji ti se mikroorganizmi nazivaju mljekarskim kulturama ili starterima, a značaj njihove uloge je u slijedećem: prvo, proizvodnja mliječne kiseline kao rezultat fermentacije laktoze; mliječna kiselina daje specifičan i svjež okus tokom proizvodnje fermentiranih mliječnih napitaka; u proizvodnji sira mliječna kiselina ima značajnu ulogu u procesu koagulacije i u oblikovanju teksture koaguluma. Drugo, važna je idoga startera za proizvodnju hlapivih tvari (kao diacetila i acetaldehida) koje doprinose stvaranju arome mliječnih proizvoda. Treće, starter kulture mogu imati preteolitičnu ili lipolitičnu aktivnost, koje su u nekim slučajevima poželjne, osobito kod sazrijevanja nekih vrsta sira. Četvrto, starteri mogu proizvesti i neke druge tvari, kao npr. alkohol, koji je značajan u proizvodnji kumisa i kefira. Peto, kisela reakcija u mliječnim proizvodima inhibira rast patogenih i sporogenih mikroorganizama.

Tradicionalno, u proizvodnji sira ili fermentiranih mliječnih napitaka, mlijeko se ostavljalo da se prirodno ukiseli. Taj način proizvodnje nije osiguravao ujednačenu kvalitetu proizvoda a kod nekih proizvoda su se mogli pojaviti neželjeni efekti fermentacije. Ti razlozi bili su poticaj za početak izučavanja starter-kultura, te je detaljno proučen njihov rast i metabolizam.

Proizvodnja fermentiranih mliječnih proizvoda svakodnevno je po svom obimu sve veća i više ceniralizirana, pa stoga mljekarske kulture postaju sastavni dio uspješnosti industrijske proizvodnje, a njihova primjena ima utjecaj i na ekonomske efekte finalnog proizvoda. Žato je u pogledu ekonomske valorizacije sira i fermentiranog mlijeka klasifikacija, umnožavanje i čuvanje mljekarskih kultura od posebnog značaja.

Uvod

Najstarija poznata metoda koja služi za produženje trajnosti hrane je fermentacija. Tipičan primjer je mliječno-kisela fermentacija koja se upotrebljava u proizvodnji fermentiranih mliječnih proizvoda kao što su sir, fermentirani mliječni napici (jogurt, acidofilno mlijeko, ymer, skyn, filmjolk, fermentirana stepka, i dr.), fermentirano vrhnje i kiselo-alkoholni mliječni proizvodi kao što su kefir i kumis.

Fermentacija je rezultat prisutnosti mikroorganizama (bakterija, kvasaca, plijesni ili kombinacije ovih mikroorganizama) i njihovih enzima u mlijeku. U mljekarskoj industriji ti se mikroorganizmi nazivaju mljekarskim kulturama ili starterima, a značaj njihove uloge je u slijedećem: prvo, proizvodnja mliječne kiseline kao rezultat fermentacije laktoze; mliječna kiselina daje specifičan i svjež okus tokom proizvodnje fermendranih mliječnih napitaka; u proizvodnji sira mliječna kiselina ima značajnu ulogu u procesu koagulacije i u oblikovanju teksture koaguluma. Drugo, važna je uloga startera za proizvodnju hlapivih tvari (kao diacetda i acetaldehida) koje doprinose stvaranju arome mliječnih proizvoda. Treće, starter kulture mogu imati preteolitičnu ili lipolitičnu aktivnost, koje su u nekim slučajevima poželjne, osobito kod sazrijevanja nekih vrsta sira. Četvrto, starteri mogu proizvesti i neke druge tvari, kao npr. alkohol, koji je značajan u proizvodnji kumisa i kefira. Peto, kisela reakcija u mliječnim proizvodima inhibira rast patogenih i sporogenih mikroorganizama.

Tradicionalno, u proizvodnji sira ili fermendranih mliječnih napitaka, mlijeko se ostavljalo da se prirodno ukiseli. Taj način proizvodnje nije osiguravao ujednačenu kvalitetu proizvoda a kod nekih proizvoda su se mogli pojaviti neželjeni efekd fermentacije. Ti razlozi bili su podcaj za početak izučavanja starter-kultura, te je detaljno proučen njihov rast i metabolizam.

Proizvodnja fermentiranih mliječnih proizvoda svakodnevno je po svom obimu sve veća i više centralizirana, pa stoga mljekarske kulture postaju sastavni dio uspješnosti industrijske proizvodnje, a njihova primjena ima utjecaj i na ekonomske efekte finalnog proizvoda. Zato je u pogledu ekonomske valorizacije sira i fermendranog mlijeka klasifikacija, umnožavanje i čuvanje mljekarskih kultura od posebnog značaja.

I. Klasifikacija mljekarskih kultura

U procesu fermentacije, tijekom proizvodnje sira i drugih fermentiranih mliječnih proizvoda, upotrebljava se više vrsta mikroorganizama (bakterije, kvasci, plijesni ili njihove kombinacije).

Tablica 1. Klasifikacija i diferencijacija mljekarskih starter-kultura (T a m i m e, 1983)

Izostavljeno iz prikaza

I. BAKTERIJE

Lactobacillus (štapićasti oblik)
rastu pri 10°C
rastu pri 45°C
fermentiraju ribozu
tvore plin od glukonata
A. Mliječno-kisela fermentiraja
(okrugli i ovalni oblici)
Fermentacija glukoze
heterofermentativne vrste
Betabacterium
Lact. brevis
Enterococci
rastu pri 10°C
rastu pri 45°C
Str. faecium
homofermentativne vrste
Termobacterium + –
Lact. bulgaricus
Lact. lactis
Lact. helveticus
Lact. acidophilus
i
Streptobacterium ± +
Lact. casei
Lact. plantarum
Enterococci + +
rastu pri 10°C
rastu pri 45°C
Str. faecium
Fermentacija glukoze
homofermentativnevrste
Streptococcus spp.
mliječni sieptokoki
mezofilni
Str. laclis
Str. lactis subsp.
diacetylactis
Str. cremoris
heterofermentativne vrste
Leuconostoc cremoris
termofilni + (pri 50°C)
Str. thermophilus
B. Mješovite fermentacije
Bre. linens
P. freudenreichii subsp. shermanii

II. PLIJESNI

Bijele plijesni
Penicillium camemberti: sivozelene koionije, izrazita proteolitična aktivnost Penicillium caseicolum: konidije su bezbojne, slabija proteolitična aktivnost Penicillium candidum
Plave plijesni
Penicillium roqueforti: tamnozelena plijesan, konidiofore su kratke
Mješovite plijesni
Mucor rasmusen, Aspergillus oryzae

III. KVASCI

Saccharomvces keflr
Saccharomvces lactis
Torulopsis kefir
Candida kefir*

* Candida kefir je novi naziv za taj kvasac;
+, raste ili fermentira;
ne raste ili ne fermentira;
±, slabo raste ili slabo fermentira

Tablica 2. Mane mlijeka i fermentiranih mliječnih proizvoda uzrokovane bakterijama mliječno-kiselog vrenja (S h a r p e, 1978)

Izostavljeno iz prikaza

Proizvod Mana
Mlijeko kiseljenje okus po sladu sluzavost
Mekani sirevi
čedar romano čedar gorčina okus po voću ružičasta obojenost narančasti pigment
Tvrdi sirevi edamac gouda edamac neodgovarajuća tekstura nadimanje neodgovarajuća tekstura okus po fenolu rast klostridija
Maslac okus po sladu
Proizvod Uzrok
Mlijeko mliječna kiselina aldehidi polisaharidi
Mekani sirevi čedar romano čedar peptidi esteri oksidacija sira rast kromogenih bakterija
Tvrdi sirevi edamac gouda edamac CO2 co2 proteoliza redukcija nitrata
Maslac aldehidi
Proizvod Mikroorganizam
Mlijeko streptokoki streptokoki, laktobacili streptokoki, laktobacili
Mekani sirevi čedar romano čedar streptokokna kultura streptokokna kultura laktobacili laktobacili
Tvrdi sirevi edamac gouda edamac streptokoki laktobacili laktobacili laktobacili laktobacili
Maslac streptokokna kultura

Tablica 3. Primjena starter-kultura u mljekarskoj industriji (T a m i m e, 1983)

Mikroorganizam
Proizvod
Prisutni mikroorganizmi u kulturi
Mliječno-kisela fermentacija
Mezofilne bakterije
1. Str. lactis tvrdi sirevi …. 1, 2, 3, 4, 5
2. Str. lactis subsp. diacetylactis polutvrdi sirevi …. 1,2, 3, 4
3. Str. cremoris
4. L. cremoris meki sirevi …. 1,2, 3, 4
Termofilni mikroorganizmi
5. Str.faecium
6. Str. thermophilus
7. Lac. bulgaricus sirevi s plijesni na površini sira …. 1, 2, 3, 4, 13, 14, 15
8. Lac. lactis sirevi s plijesni u unutrašnjosti sira… …. 1, 2, 3, 4, 16
Plijesni i kvasci sirevi s visokom temperaturom
13. P. camemberti dogrijavanja (Parmezan, Romano) … 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
14. P. caseiocolum (Ementaler, Groyer) 6, 7, 8, 9, 22
15. P. candium
16. P. roqueforti
17. S. kefir v sirevi sa sluzi na površini 1,2,3,20
18. S. lactis >C. kefir
19. T. kefir kiselo vrhnje, fermentirani maslac i stepka 2, 3, 4
– jogurt i skyr 6, 7
Različite fermentacije
20. Bre. linens
21. Bif. bifitdum
22. P. freudenreichii jogurt namijenjen u Ijekovite svrhe .. 6, 7, 11, 21
subsp. shermanii kefir 1. 4, 7, 10, 11, 17, 18, 19
– kumis i Lac. brevis 1. 6, 7, 18 i Torulopsis
– ymer sp. 1,2, 3, 4
– yakult 10
– laktofil, gradfil i filmjolk 1,2, 3, 4

Klasifikacija mljekarskih kultura, kako je prikazano na tablici 1 (prema Tamime, 1983), samo je opći pristup identifikaciji tih mikroorganizama. Uspješnost proizvodnje sira i drugih fermentiranih mliječnih proizvoda, međutim, oslanja se na pravilan izbor mikroorganizama za specifičan tip fermentacije. U prilog tome govore i podaci da i bakterije mliječno-kiselog vrenja ili mliječne kiseline iz sastava mljekarskih kultura mogu ponekad biti uzročnici kvarenja fermentiranih mliječnih proizvoda (tab. 2).

Mikroorganizmi koji se upotrebljavaju u mljekarskoj proizvodnji mogu se upotrebljavati pojedinačno, po dvije vrste ili više njih (T a m i m e, 1983), što omogućuje proizvodnju različitih vrsti fermentiranih mliječnih proizvoda.

U tablici 3 prikazana je primjena i kombinacije tih mikroorganizama potrebnih za proizvodnju sira, fermentiranih mlijeka, kiselog vrhnja, fermentirane stepke, kefira i kumisa.

II. Genetičko inženjerstvo bakterija namijenjenih proizvodnji fermentiranih mliječnih proizvoda

Neke vrlo važne proizvodne osobine bakterija mliječno-kiselog vrenja ili bakterija mliječne kiseline često su nestabilne. Genetička istraživanja su pokazala da su neki geni koji nadziru (kontroliraju) npr. metabolizam laktoze ili aktivnost proteinaza smješteni u plazmidima (McKay i Baldwin, 1974). Plazmidi su kružni dijelovi DNK u citoplazmi bakterijske stanice koji se umnožavaju (repliciraju) neovisno o kromosomskoj DNK u staničkoj jezgri. Mnogi su plazmidi »kriptični« − nose neidentificirane gene, mada se zna da se u nekih bakterijskih sojeva geni koji nadziru laktoznu permeazu (lak geni) i proteinazu (prt geni) nalaze u plazmidima. Budući da plazmidi umnožavaju DNK neovisno o kromosomima, svaka mutacija pri kojoj se ne umnožava plazmid rezultira u stanici-kćeri gubitkom osobine kodirane izgubljenim plazmidom. Istraživanjem streptokoka mliječno-kiselog vrenja ustanovilo se da mnogi sadržavaju znatne količine plazmidne DNK i da su mnoge osobine, kao iskorištavanje laktoze, citrata, saharoze, galaktoze, glukoze, manoze i ksiloze, zatim proteolitična aktivnost i proizvodnja nisina fenotipski vezane uz plazmide. Za neke druge osobine, kao za hidrolizu arginina ili proizvodnju sluzavih tvari ustanovilo se da su zapravo fenotipski gubitak metaboličkih osobina. Za otpomost prema lijekovima ili sposobnost proizvodnje diplokokcina drži se da je također vezana uz plazmide, ali to još nije potvrđeno (McKay, 1983).

Poznavanje osobina plazmida može poslužiti određivanju fenotipskih i ostalih genotipskih osobina pri identifikaciji bakterija.

Plazmidi se mogu prenositi između vrsta i sojeva mliječnih streptokoka preko sustava prijenosa gena. Ta spoznaja može biti korisna za poboljšavanje pojedine osobine sojeva za mljekarske kulture (M c Ka y, 1983).

Od postupaka koji se upotrebljavaju za prijenos gena i modifikaciju genoma bakterija (transdukcija, konjugacija i fuzija protoplasta) uspješno se primjenjuju i u bakterija mliječno-kiselog vrenja (G a s s o n, 1983).

Proučavanje plazmida je također preduvjet za kloniranje gena koji će vjerojatno u budućnosti postati postupak za pripremu novih sojeva, tvrdi d e Vos (1986).

U posljednjih deset godina učinjen je veliki napredak u istraživanju genetike bakterija mliječno-kiselog vrenja. Većina radova odnosila se na mezofilne streptokoke (Kempler i McKay, 1981; Gasson, 1983; Konđo i Mc Kay, 1985). Najveće zanimanje istraživača privukli su plazmidi i prijenosni sustavi gena. Uočeno je da streptokoki mliječno-kiselog vrenja mogu imati neke nestabilne osobine, kao npr. metabolizam laktoze i proizvodnju proteinaza (McKay i sur., 1976). Mnogi streptokoki mliječno-kiselog vrenja mogu sadržavati u svojoj citoplazmi više plazmida pa se time mogu objasniti njihove nenadane promjene djelovanja (M c Ka y, 1983).

Prema Petterssonu (1988), streptokoki mliječno-kiselog vrenja najčešće sadržavaju 2 do 11 različitih plazmida pa su mnoge važne osobine tih streptokoka kodirane genima koji su smješteni u plazmidnoj DNK. Tablica 4 prikazuje podatke o osobinama streptokoka mliječno-kiselog vrenja na koje utječu plazmidi.

Tablica 4. Osobine streptokoka mliječno-kiselog vrenja na koje utječu plazmidi (Pettersson, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Osobina na koju utječe plazmid i vrsta bakterija

matabolizam laktoze
S. lactis
S. lactis subsp. cremoris
S. lactis subsp. diacetylactis
metabolizam galaktoze
S. lactis
proteolitična aktivnost
S. lactis
S. lactis subsp. diacetylactis
iskorištavanje citrata
S. lactis subsp. diacetylactis
antagonističke osobine (nisin, diplokokcin)
S. lactis
S. lactis subsp. cremoris
otpornost prema antibioticima
S. lactis
tvorba sluznih tvari
S. lactis subsp. cremoris
otpornost prema fagima
S. lactis subsp. cremoris

Fryder (1978) i Vescovo i sur. (1981) dokazali su da plazmidi postoje i u laktobacilima i da je uz njih često vezana otpomost laktobacila prema lijekovima (V e s c o v o i sur., 1982), i metabolizam laktoze.

Neke od važnih osobina termofilnih laktobacila i streptokoka kodiraju geni smješteni u plazmidima. Tablica 5 prikazuje neke osobine termofilnih mljekarskih kultura na koje posredno utječu plazmidi.

Tablica 5. Osobine termofilnih mljekarskih kultura na koje utječu plazmidi (Dellaglio, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Osobina
Sojevi bakterija
metabolizam laktoze fermentacija
L. helveticus
N-acetil-D-glukozamina
L. helveticus subsp. joghurt
proteolitično djelovanje
L. helveticus
otpornost prema lijekovima
L. acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus
proizvodnja bakteriocina
L. acidophilus
proizvodnja polisaharida
L. delbrueckii subsp. bulgaricus, S. thermophilus

III. Taksonomija i metabolizam mikroorganizama važnih za proizvodnju fermentiranih mliječnih proizvoda

1986. godine izašla je nova edicija »Bergeys Manual of Systematic Bacteriology« u kojoj su mnogi nazivi mikroorganizama, upotrijebljenih za proizvodnju fermentiranih mliječnih napitaka i sireva, promijenjeni. Tablica 6 (Puhan, 1988) prikazuje popis starih i novih naziva za mikroorganizme koji se upotrebljavaju u proizvodnji fermentiranih mliječnih proizvoda.

Tablica 6. Nazivi mikroorganizama u fermentiranim mliječnim proizvodima Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2 (1986). The Yeasts, − A Taxonomic Study, 3rd Ed., Elsevier, Aplied Science Publishers Amsterdam (1984) (Prema P u h a n, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Novi naziv i dosadašnji nazivi

1. Bakterije

Genus Lactobacillus
Lactobacillus delbrueckii
Bacillus delbrueckii: Bacillus acidificans longissimus; Bacterium delbrueckii; Lactobacillus delbrueckii; Thermobacterium cereale; Lactobacterium delbrueckii; Ulvina delbrueckii; Plocamobacterium delbrueckii
L. delbrueckii subsp. lactis
Bacillus lactis acidi; Bacterium lactis acidi; Thermobacterium lactis; Lactobacillus lactis acidi; Lactobacterium caucasicum var. lactis; Lactobacillus lactis; Bacillus Leichmannii I; Bacillus Leichmannii III; Lactobacterium Leichmannii; Lactobacillus Leichmannii
L. delbrueckii subsp. bulgaricus
Lactobacillus longus; Bacillus bulgaricus; Bacterium bulgaricum; Plocamobacterium bulgaricum; Bacterium biogurt; Lactobacterium bulgaricum; Lactobacillus bulgaricus
L. acidophilus, L. helveticus
Bacillus acidophilus; Thermobacterium intestinale
Bacillus 2; Bacillus 2 casei; Caseobacterium; Thermobacterium helveticum; Lactobacillus helveticum; Plocamobacterium helveticum; Lactobacterium helveticum
L. casei
Bacillus Cl; Bacillus casei Cl; Caseobacterium vulgare; Ba-cterium casei Cl; Streptobacterium casei; Lactobacterium casei
L. brevis
Bacillus Y; Bacillus casei Y; Lactobacterium breve; Betaba-cterium breve; Saccharobacillus pastorianus var. beroli-nensis; Bacillus lindneri; Bacillus fasciformis; Bacillus bra-ssicae fermentatae; Lactobacillus pentoaceticus; Bacillus pa-nis fermentati; Bacterium soya; Bacillus acidophil-aeroge-nes; Lactobacillus rudensis; Lactobacillus pastorianus; La-ctobacterium lindneri; Lactobacillus lindneri; Lactobacillus berolinensis; Lactobacillus panis; Lactobacillus soya; Lacto-bacillus fermentatae; Lactobacillus brovvnii; Bacterium lin-dneri; Plocamobacterium pentoaceticum; Lactobacillus bre-vis var. rudensis; Lactobacillus pentoaceticus; Lactobacte-rium fascioformis; Lactobacterium lindneri; Betabacterium arabionosaceum; Lactobacillus pastorianus
L. fermentum
Bacillus 6 ; Bacillus casei 5 ; Lactobacterium fermentum; Lactobacillus fermenti; Betabacterium Jensenii; Bacterium gayoni; Lactobacillus gayoni: Betabacterium longum; La-ctobacillus longus; Lactobacterium longum
L. kefir
Lactobacillus caucasicus; Bacillus caucasicus; Bacterium caucasicum; Betabacterium caucasicum

2. Genus Streptococcus

Streptococcus lactis
Bacterium lactis
S. lactis subsp. diacetylactis
Streptococcus diacetylactis
S. lactis subsp. cremoris
Streptococcus hollandicus; Streptococcus lactis B; Strepto-coccus cremoris
S. thermophilus
Streptococcus thermophilus

3. Genus Leuconostoc

Leuconostoc mesenteroides
Ascococcus mesenteroides; Betacoccus arabinosaceus
L. mesenteroides subsp. dextranicum
Lactococcus dextranicus; Betacoccus bovis; Streptococcus paracitrovorus; Betacoccus cremoris N; Streptococcus kefir; Leuconostoc dextranicum
L. mesenteroides subsp. cremoris
Betacoccus cremoris X; Leuconostoc citrovorum: Leuconostoc cremoris
L. lactis
Streptococcus kefir

4. Genus Pediococcus

Pedioccus pentosaceus
Tetracoccus N. 2; Pediococcus hennebergii; Pediococcus parvulus
P. acidilactici
Pediococcus lindneri

5. Genus Bifidobacterium

Bifidobacterium bifidum
Bacillus bifidus communis; Bacillus bifidus; Bacterioides bifidus; Bacterium bifidum; Tisseria bifida; Nocardia bifida; Actinomyces bifidus; Actinobacterium bifidum; Bifidibacterium bifidum; Lactobacillus bifidus; Lactobacillus parabifidus; Cohnistrepto-thrix bifidus; Actinomyces parabifidus
B. longum
Bifidobacterium longum subsp. animalis
B. infantis
Bifidobacterium liberorum; Bifidobacterium lactensis; Bifidobacterium parabifidum
B. breve
Bifidobacterium parvulorum

6. Genus Acetobacter Acetobacter aceti

Mycoderma aceti; Bacterium aceti; Bacteriopsis aceti; Mi-crococcus aceti; Bacillus aceticus; Bacterium acetigenoide-um, Acetobacter ketogenum; Acetobacter lafarianum; Aceto-bacter aceti var. muciparum

7. Kvasci

Torulaspora delbrueckii
Saccharomyces delbrueckii
Kluyveromyces marxianus subsp. marxianus
Saccharomyces kefir; Saccharomyces fragilis; Kluyveromy-ces fragilis
Khivveromvces marxianus subsp. bulgaricus
Saccharomyces fragilis var. bulgaricus
Candia kefyr
Saccharomyces kefyr; Torulopsis kefyr; Candida pseudotro-picalis var. lactosa
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae

Saznanja o klasifikaciji i metabolizmu bakterija općenito, kojima raspolažemo u današnje vrijeme, nisu definitivna. I klasifikacija i metabolizam bakterija podložni su promjenama u svjetlu novih informacija koje postaju dostupne preko mnogobrojnih istraživanja.

1. Kulture za fermentirane mliječne napitke

Tablica 7 prikazuje faktore koji utječu na osobine različitih vrsti fermentiranog mlijeka.

Podaci iz tab. 7 pokazuju da mljekarske kulture zauzimaju vrlo važno mjesto u uspješnoj proizvodnji kvalitetnih tekućih fermentiranih mliječnih proizvoda.

Bakterije mliječno-kiselog vrenja koje se upotrebljavaju u proizvodnji različitih vrsti fermentiranog mlijeka dijele se u nekoliko fenotipskih i genotipskih skupina. One se razlikuju po različitim prehrambenim zahtjevima, metabolizmu, uzgojnim i tehnološkim osobinama pa otuda i tako veliki broj njihovih sojeva.

Taksonomski položaj i filogenetičko srodstvo bakterija mliječno-kiselog vrenja osniva se na serofoškim (Sharpe, 1985), enzimnim (Gasser, 1970; London i Kline, 1973; London i Chace, 1983), imunološkim (Ludwig i sur., 1985) i prehrambenim (Desmazeaud, 1983) osobitostima stanične stijenke i na sastavu oligonukleotida njihove 16S rRNK (Stackebrandt i sur., 1983). Najveći dio taksonomskih osobina ustanovljen je proučavanjem molekularne građe DNK, posebno njezinim gvanin-citozin sastavom (GC°/o), kao i postotaka genskih homologa nakon DNK-DNK hibridizacije.

Tablica 7. Faktori koji utječu na osobine različitih vrsti fermentiranog mlijeka

Povoljni učinak

dobra kakvoća
normalni sastav + 1% obra-nog mlijeka u prahu
ako je više od 1% mlječne masti
3 min pri 90°C
15 do 22°C
Bili BD-tip
pH 4,6; fermentirana li-munska kiselina
vakuumiranje prije hlađenja
brzo hlađenje; aeracija 1 sat
8°C

Proizvodni proces

mlijeko
↓
suha tvar mlijeka bez masti
↓
homogenizacija
↓
pasterizacija
↓
temperatura inkubacije
↓
mljekarska kultura
↓
naknadno djelovanje
↓
izdvajanje CO2
↓
aroma
↓
skladištenje

Nepovoljni učinak
strani okus/miris, velika količi-na bakterija
niža od 8,9%
manje od 15 sek pri 90°C
> 23°C
Oili D-tip
pH > 4,6; limunska kiselina nije kompletno fermentirana
vakuumiranje poslije hlađenja
polagano hlađenje u fermento-ru
> 8°C

1.1. Razlike između bakterija mliječne kiseline i drugih srodnih vrsta

Neki sojevi heterofermentativnih laktobacila koji nalikuju na kokoidne štapiće, poput leukonostoka, razlikuju se od leukonostoka po svojoj sposobnosti da mogu proizvoditi DL-mliječnu kiselinu umjesto samo njezin D (-) izomer. Razlika između streptokoka s atipičnim izduženim stanicama i kokoidnih laktobacila može se otkriti DNK-DNK hibridizacijom. Razlika između laktobacila i kuglastih štapića bifidobakterija može se ustanoviti prema njihovom načinu fermentacije heksoza, tj. pojave mliječne i octene kiseline umjesto mliječne kiseline, octene kiseline i CO2.

1.1.1. Rod Lactobacillus

Rod Lactobacillus obuhvaća nesporogene gram-pozitivne bacile. Laktobacili su mikroaerofilni, reduciraju nitrate, citokrom katalaza su negativni i imaju 32-53% GC u DNK Dijele se u tri grupe, ali ovdje će se opisati samo one vrste koje sudjeluju u proizvodnji fermentiranih mlijeka.

Tablica 8. Morfološke i fiziološke osobine laktobacila koji se upotrebljavaju u mljekarskim kulturama za proizvodnju različitih vrsti fermentiranog mlijeka (Bergeys Manual, 1986)

Vrsta laktobacila
L. delbrueckii subsp. delbrueckii
L. delbrueckii subsp. lactis
L. delbrueckii subsp. bulgaricus
L.helveticus
L. acidophilus
L.casei subsp. casei
L. casei subsp. rhamnosus
L. casei subsp. tolerans
L. brevis
L. fermentum
L. kefir
GC (%) Rast pri 15°C
Mliječna kiselina izomer
Elektroforetska pokretljivost
NH3 kis. u mlijeku
% mg. kis. u mlijeku
Metakromatske granule
Fermentira
amigdalin
arabinozu
celobiozu
eskulin galaktozu
glukonat
laktozu
maltozu
manitol
manozu
melicitozu
melibiozu
rafinozu
ramnozu
ribozu
salicin sorbitol
saharozu
trehalozu
ksilozu
D-LDH
L-LDH

Tumač znakova pod (b):

(+) 90% ili više sojeva pozitivno;
(-) 90% ili više sojeva negativno;
(d) 1 1-89% sojeva pozitivno;
(w)nepouzdana reakcija.

Svi fermentiraju glukozu i fruktozu.

GRUPA 1. Striktno homofermentativni laktobacili

To su bakterije koje fermentiraju heksoze preko Embden-Meyerhove razgradnje u mliječnu kiselinu. Ne fermentiraju pentoze i glukonate. Ne proizvode CO2. Ova grupa bakterija sadrži 15 vrsta (Bergeys Manual, 1978) ali samo L delbrueckii, L. helveticus i L. acidophilus upotrebljavaju se pri proizvodnji fermentiranih mliječnih napitaka.

Tablica 8 sadrži važne karakteristike tih vrsta bakterija. Njihova diferenciiacija utvrđena je preko fenotipskih i genotipskih karakteristika. Uvažavajući DNK-DNK hibridizaciju kao jedan važan podatak u taksonomiji, ove bakterije mliječno-kiselog vrenja mogu se podijeliti u dva ogranka srodnih vrsta i podvrsta. Prvi ogranak koji obuhvaća vrste L. delbrueckii, L. lactis, L. bulgaricus i L. leichmanii smatra se podvrstom L. delbrueckii (W e i s s i sur., 1983) .

Nova terminologija prema Bergeys Manual (1986) je: L. delbrueckii subsp. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. lactis i L. delbrueckii subsp. bulgari-

Navedene podvrste razlikuju se prema sposobnosti fermentacije ugljikohidrata.

L. acidophilus i L. helveticus vrste pripadaju drugom ogranku ove grupe (tablica 8). Blisko su srodne jedna drugoj s obzirom na % GC i nekim drugim biokemisjkim karakteristima, ali nisu srodne s obzirom na fermentacije i DNK-DNK homolognost.

GRUPA 2. Fakultativno heterofermentativni laktobacili

Važna karakteristika ovih bakterija je njihova sposobnost fermentacije heksoza preko Embden-Meyerhofovog ciklusa razgradnje do mliječne kiseline i sposobnost razgradnje pentoza do mliječne i octene kiseline. Od 11 vrsta koje se nalaze u ovoj grupi, samo su L. casei i njegove podvrste često prisutni u fermentiranim mliječnim napicima. Taksonomija tih vrsta još uvijek se istražuje i o njoj se raspravlja, jer L. casei subsp. casei i L. casei subsp. rhamnosus pokazuju slične GC°/o, biokemijske i fermentativne karakteristike (tablica 8), ali nisku DNK-DNK homologiju (D e 11 a g 1 i o, 1975).

GRUPA 3. Striktno heterofermentativni laktobacili

18 vrsta ove grupe, izuzevši L. bifermentans, fermentira heksoze u mliječnu kiselinu, octenu kiselinu (ili etanol) i CO2, zatim fermentiraju pentoze u mliječnu i octenu kiselinu. U oba metabolitička ciklusa sudjeluje enzim fosfoketolaza. Samo tri vrste striktnih heterofermentativnih laktobacila sudjeluju u proizvodnji fermentiranih mlijeka: L. brevis, L. fermentum i L. kefir. Njihove glavne fenotipske i genotipske karakteristike nalaze se u tablici 8.

1.1.2. Rod Streptococcus

Bakterije koje pripadaju ovom rodu pojavljuju se u velikom broju podvršta i neke od njih vrlo su važne u proizvodnji fermentiranih mliječnih napitaka. To su gram-pozitivni koki, fakultativni anaerobi, katalaza − negativni, kemoorganotrofni mikroorganizmi. Fermentiraju heksoze do mliječne kiseline. Rod Streptococcus sadrži za mljekarsku proizvodnju tri osobito važne vrste: mliječni streptokoki (S. lactis i njegove podvrste i S. raffinolactis) i S. thermophilus.

Garvie i Farrow (1982) podijelili su S. lactis u tri podvrste: S. lactis subspecies lactis, S. lactis subsp. diacetylactis i S. lactis subsp. cremoris. Premda S. lactis subsp. lactis pokazuje visoki stupanj sličnosti s S. lactis subsp. diacetylactis, glavna razlika je upotreba citrata kod diacetylactis podvrste. S. lactis subsp. cremoris, metabolitski slabije aktivan od ostalih podvrsta, nalazi se u sastavu više mljekarskih kultura. S. rajfinolactis kojeg je opisao Garvie (1978), filogenetički je vrlo blizak S. lactis, ali se razlikuje po DNK-DNK homolognosti.

Treća vrsta, S. thermophilus (poznata po brzom rastu u lakmus-mlijeku pri 45°C i nesposobnosti rasta pri 10°C), posebna su vrsta streptokoka koji vrlo dobro rastu pri 45°C u mlijeku. Ti streptokoki vrlo dobro rastu u simbiozi s podvrstom L. delbriickii subsp. bulgaricus.

Tablica 9. Karakteristike streptokoka mliječno-kiselog vrenja i vrste S. thermophilus (B e r g e y s Manual, 1986)

Izostavljeno iz prikaza

S. lactis subsp.

Karakteristike bakterija
lactis
diacety-lactis
cremoris
S. raffinolactis
S. thermophihis
R a s t
pri 10C + + + + –
pri 40”C + + d – +
pri 45°C – – – – +
pri pH o,2 + ++ + – –
uz 4% NaCl + + — – –
uz 0,3% metilen plavila u mlijeku + + – –
H i d r o 1 i z a
arginina + + – – +
hipurata d d d d –
eskulina d d d + –
Ko r i š t e n j e
citrata – + d – –
Tvorba kiseline od
ksiloze + — – + —
maltoze + + – + (d)
saharoze – — — + d
trehaloze + d (d) +
rafmoze – – (d) + –
ramnoze – — – + –
riboze + + – — —
dekstrina + + — + —
sorbitola – – – + –

Dezmazeaud i neki drugi znanstvenici (1983) predložili su da se S. thermophilus razvrsta kao S1. salivarius subsp. thermophilus. Štoviše, S c h l eifer i sur. (1985) predlažu da se svi streptokoki mliječno-kiselog vrenja zajedno s Lactobacillus xylosus, L. hordinae, S. gavris i S. plantarum uvrste u novi rod »Lactococcus«. Iz toga se može zaključiti da će u bliskoj budućnosti biti još nekih promjena u klasifikaciji bakterija mliječno-kiselog vrenja.

U tablici 9. nalaze se važne karakteristike vrsta i podvrsta streptokoka mliječno-kiselog vrenja.

1.1.3. Rod Leuconostoc

Bakterije koje pripadaju ovom rodu imaju okrugle stanice, katalaza su negativne, nemaju citokrom, ne hidroliziraju arginin, ne zakiseljavaju mlijeko. Najčešće se izoliraju s povrća i iz mliječnih proizvoda. Njihov rast ovisi o prisutnosti ugljikohidrata koje mogu fermentirati. Glukozu fermentiraju preko heksoza-monofosfat i fosfoketolaza ciklusa, krajnji produkti fermentacije glukoze su CO, i D (-) mliječna kiselina. Morfološki je vrlo teško razlikovati leukonostoke, streptokoke i neke heterofermentativne laktobacile.

Proizvodnja plina od glukoze i D (-) mliječne kiseline karakteristike su koje odvajaju leukonostoke od streptokoka. Streptokoki, naime, ne proizvode CO i proizvode L (+) mliječnu kiselinu.

Tablica 10. Karakteristike L. mesenteroides i L. lactis (B e r g e y s M a n u a 1, 1986)

Izostavljeno iz prikaza

Karakteristike bakterija
L. mesenteroides subsp. L. lactis
mesenteroides, dextranicum, cremoris
Kiselina od
arabinoze d – – –
celuloze + d – –
fruktoze + + – +
saharoze + + – +
trehaloze + + – –
Hidroliza eskulina d d – –
Proizvodnja dekstrana + + – –
Potrebe za rast
uracil – – + –
riboflavin d d + +
piridoksal d d + –
folna kiselina d d + –
Disimilacija citrata d d + d
Rast
uz 3% NaCl + d – d
pri 37°C d + – +
GC % 37-39 37-40 58-40 43-45

Usporedne analize nekih biokemijskih, fermentativnih i genetičkih karakteristika leukonostoka i laktobacila koji proizvode plin (L. confusus i L. viridescens) pokazuju da su oni bliži leukonostocima nego drugim laktobacilima (S h a rp e i sur., 1972).

Istraživanja Garvia (1984) o enzimima i DNK-DNK hibridizaciji pokazala su da se rod Leuconostoc sastoji od 4 vrste: L. mesenteroides, L. paramesenteroides, L. lactis, L. oenos. Isti autor je utvrdio da se L. mesenteroides sastoji od podvrsta mesenteroides dextranicum i cremoris. U fermentiranom mlijeku najčešće se susreću L. mesenteroides subsp. cremoris i L. lactis. Neke od karakteristika L. mesenteroides i L. lactis prikazane su u tablici 10.

1.1.4. Rod Pediococcus

Pediokoki su jedine bakterije mliječno-kiselog vrenja koje se dijele u formi tetrada. Fermentiraju ugljikohidrate i glukozu preko Embden-Meyerhovog ciklusa na DL, D(-) ili D (+) mliječnu kiselinu. Ne proizvode plin. To su katalaza − negativne bakterije i nemaju citokrom. Rod Pediococcus obuhvaća: P. damnosus, P. parvulus, P. inopinatus, P. dextrinicus, P. pentosaceus, P. acidilactici, P. halophilus i P. urinae-equi (Back, 1978). U fermentiranim mliječnim proizvodima i mlijeku nalaze se samo P. pentosaceus i P. acidiiactici, ali oni su manje važni u mljekarskoj proizvodnji od ostalih bakterija mliječno-kiselog vrenja (D e 11 a g 1 i o i sur., 1974).

Tablica 11 prikazuje osobine vrsta P. pentosaceus i P. acidilactici (prema Bergey”s Manual, 1986).

Tablica 11. Važne karakteristike P. pentosaceus i P. acidilactici (Bergeys Manual, 1986)

Izostavljeno iz prikaza

Osobina bakterije P. pentosaceus
Rast
pri 50°C –
uz 10% NaCl d
Kiselina od
arabinoze +
ksiloze d
maltoze +
trehaloze +
%-tak GC 35 do 39
Osobina bakterije P. acidilactici
Rast
pri 50°C –
uz 10% NaCl –
Kiselina od
arabinoze d
ksiloze +
maltoze –
trehaloze d
%-tak GC 38 do 44

1.1.5. Rod Bifidobacterium

U nekim fermentiranim mliječnim proizvodima bifidobakterije se upotrebljavaju u zajednici š bakterijama mliječno-kiselog vrenja. Nekoliko vrsta nalazi se u stolici dojenčadi i odraslih i upotrebljavaju se u probiotičke svrhe.

Te bakterije imaju vrlo promjenljiv štapićasti oblik stanica. To su grampozitivne, nesporogene, nepokretne, anaerobne, katalaza negativne i saharolitične bakterije. Glukozu upotrebljavaju preko fruktoza-6-fosfat ciklusa uz proizvodnju octene i mliječne kiseline u molarnom odnosu 3:2. Ne proizvode CO2, a uglavnom NH3 upotrebljavaju kao izvor dušika. GC % je od 55 do 67. U »Bergeys Manual of Systematic Bacteriology« (1986), navodi se da je od 24 vrste samo slijedećih 9 često prisutno u probavnom traktu čovjeka: B. bifidum, B. longum, B. infantis, B. breve, B. adolescentis, B. angulatum, B. catenulatum, B. pseudocatenulatum i B. dentium.

Vrste koje se upotrebljavaju za proizvodnju fermentiranih mlijeka su: B. bifidum, B. longum, B. infantis i B. breve. U tablici 12 nalaze se karakteristike za diferencijaciju te četiri vrste bakterija.

Tablica 12. Karakteristike za razlikovanje B. bifidum, B. longum, B. infantis i B. breve (D e 11 aglio, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Karakteristike B. breve
Morfologija tanke i kratke stanice
Kiselina od
D-riboza +
L-arabinoza –
laktoza +
melecitoza d
rafinoza d
ksiloza +
manoza +
saharoza +
maltoza +
salicin +
Potreba za
riboflavin N. A.
pantotenat N. A.
nikotinska kiselina N. A.
folna kiselina N. A.
p-aminobenzojeva kiselina N. A.
Prisutnost plazmida –
Karakteristike B. bifidum
Morfologija napravilan oblik stanica
Kiselina od
D-riboza –
L-arabinoza –
laktoza +
melecitoza –
rafinoza –
ksiloza –
manoza –
saharoza d
maltoza –
salicin –
Potreba za
riboflavin +
pantotenat –
nikotinska kiselina +
folna kiselina +
p-aminobenzojeva kiselina +
Prisutnost plazmida –
Karakteristike B. longum
Morfologija produžene i relativno tanke stanice
Kiselina od
D-riboza +
L-arabinoza +
laktoza +
melecitoza +
rafinoza +
ksiloza d
manoza d
saharoza +
maltoza +
salicin –
Potreba za
riboflavin N. A.
pantotenat N. A.
nikotinska kiselina N. A.
folna kiselina N. A.
p-aminobenzojeva kiselina N. A.
Prisutnost plazmida +
Karakteristike B. infantis
Morfologija bez osobitih svojstava
Kiselina od
D-riboza +
L-arabinoza –
laktoza +
melecitoza –
rafinoza +
ksiloza d
manoza d
saharoza +
maltoza +
salicin –
Potreba za
riboflavin –
pantotenat +
nikotinska kiselina –
folna kiselina –
p-aminobenzojeva kiselina –
Prisutnost plazmida –

(a): + potrebno, − nepotrebno. N. A. = neupotrebljivo

1.1.6. Ostali mikroorganizmi u fermentiranim mliječnim napicima i njihova taksonomija

1.1.6.1. Rod Acetobacter

Općenito, bakterije iz ovog roda najčešće se susreću u proizvodima koji sadrže alkohol i šećer: pivo, vino, zakiseljeni voćni sokovi, palmino vino, »nuta« i kefir.

To su gram-negativne bakterije elipsoidnog oblika stanica; striktno aerobne i katalaza pozitivne. Etanol oksidiraju u octenu kiselinu, a acetate i laktate u CO2 i H2O.

Rod Acetobacter sastoji se od 4 vrste: A. aceti, A. liquefaciens, A. pasteurianus i A. hansenii (Bergeys Manual, 1986). U kefirnim zrncima prisutan je A. aceti, a ovaj se mikroorganizam često uvrštava i u sastav kulture za kumis. Karakteristike A. aceti nalaze se u tablici 13.

Tablica 13. Karakteristike vrste Acetobacter aceti (Bergeys Manual, 1986)

Izostavljeno iz prikaza

Karakteristike A. aceti
Bočne flagele d

Ferri-klorid reakcija na:

D-glukozu –
D-fruktozu –
D-galaktozu –
Ketogeneza od
glicerol +
D-manitol d
sorbitol +
Reakcija Ca-D, L-laktata +
2-keto i 5-ketoglukonska kiselina glukoze +
Izvori C za rast
etanol +
D-manitol +
Na-acetat +
Na-D, L-laktat +
dulcitol –
rafinoza –
Rast u prisutnosti 10% etanola –
Kiselina od
D-ksiloze +
D-glukoze +
D-manoze +
laktoze –
glicerola –
maltoze –
etanola +
GC % 55,9-59,5

1.1.6.2. Kvasci

Neki od kvasaca prisutni u namirnicama smatraju se kontaminantima i uzrokuju nadimanje proizvoda. Međutim, često su prisutni u prirodnim mljekarskim kulturama. U kiselim i slatkim sredinama veoma dobro se razvijaju, a mogu se dobro razvijati i u prisutnosti mnogih vrsta bakterija. Najvažniji i vrlo interesantan primjer zajedničkog rasta bakterija i kvasaca su kefirna zrnca. U ovoj simbiozi osnovnu ulogu imaju kvasci. U kefimim zrncima nalazi se veliki broj vrsta i podvrsta. Najvažnije karakteristike kvasaca koji se mogu naći u kefirnim zrncima sadrži tablica 14.

Tablica 14. Neke karakteristike kvasaca izdvojenih iz kefirnih zrnaca (D e 11 a g 1 i o, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Karakteristike kvasaca
Torulaspora delbruckii
Candida kefir
Sacharomyces cerevisiae
Kluyveromyces marxianus subsp. marxianus ili bulgaricus
Fermentacija:
glukoze
galaktoze V + V + +
saharoze V + V + +
maltoze V – V – –
laktoze – V – V V
rafinoze V V V + +
inulina V + – + +
Rast na:
galaktoza V + V + +
saharoza V + V + +
maltoza V – V – –
celobioza – V – + +
laktoza – + – + +
trehaloza + V V – –
rafinoza V + V + +
D-ksiloza – V – + +
L-arabinoza – V – + V
D-riboza – V – V –
D-manitol V V – + V
ribitol – – – + +
DL-mliječna kiselina V + V + +
Rast u sredini bez vitamina V – V – –
pri 37°C – + V + +
u agaru s kukuruznim
brašnom kratki čupave pseudo- pseudo- vrlo
lanci, čupave kolonije kolonije micelij micelij razgranat pseudomicelij
GC % 42,26-44,6 41,3 38,3^12,0 40,0-41,0 41,3-13,4

V = različite reakcije

1.1.7. Metabolizam ugljikohidrata u bakterija mliječne kiseline

Bakterije mliječno-kiselog vrenja (i štapići i koki) razgrađuju ugljikohidrate putem različitih razgradnih ciklusa fermentacije i proizvode barem 90 ili 50% laktata u šlučaju homoili heterofermentativnih vršta (K a n d 1 e r, 1983).

Vršte fermentatacija u bakterija mliječno-kiselog vrenja prikazani su u tablici 15.

Tablica 15. Vrsti fermentacija u bakterija mliječno-kiselog vrenja (K a n d 1 e r, 1983)

Izostavljeno iz prikaza

Rod Vrsta fermentacije Glavni produkt
Streptococcus homo laktat
Pediococcus homo laktat
Lactobacillus
striktno homo homo laktat
fakultativno hetero homo laktat
heterod) laktat: acetat
striktno hetero hetero laktat: acetat: CO2
Leuconostoc hetero laktat: acetat: CO2
Bifidobacterium hetero laktat: acetat
Rod Vrsta fermentacije Izomer laktata
Streptococcus homo L
Pediococcus homo L, DL
Lactobacillus
striktno homo homo L. D ili DL
fakultativno hetero homo L, D ili DL
heterod) L, D ili DL
striktno hetero hetero L, D ili DL
Leuconostoc hetero D
Bifidobacterium hetero L

(1) kod fermentacije pentoza (Ka n d 1 e r, 1983)

Glavni ciklusi heksozne-fermentacije bakterijama mliječne-kiseline prisutnim u fermentiranim mliječnim proizvodima prikazani su na slici 1.

Bakterije mliječno-kiselog vrenja koje luče aldolazu (kao streptokoki, pediokoki, striktno homofermentativni i fakultativno heterofermentativni laktobacili) sudjeluju u homolaktičnoj fermentaciji, a konačni proizvod je mliječna kiselina. Bakterije mliječno-kiselog vrenja koje sadrže fosfoketolazu mogu se podijeliti u dvije grupe. Prva grupa bakterija sudjeluje u »6-P-glukonat ciklusu« (leukonostoci i striktno heterofermentativni laktobacili), a proizvode ekvimolarnu količinu CO2, laktata i acetata. Druga grupa sudjeluje u tzv. »bifidnom ciklusu« uz proizvodnju acetata i laktata u molamim odnosima 3 :2.

Fakultativno heterofermentativni laktobacili induciraju fosfoketolazu, pa mogu proizvesti acetate i laktate od pentoza.

Za bakterije mliječno-kiselog vrenja koje rastu u mlijeku upotreba laktoze veoma je važna. Većina laktobacila upotrebljava laktozu preko specifične permeaze i razlaže je zatim uz pomoć B-galaktozidaze u glukozu i galaktozu. Galaktoza prelazi u glukozu preko »Leloir ciklusa« (D e l l a g l i o, 1988), pa se zajedno s glukozom fermentira preko glikolize. Neki od laktobacila, kao L. casei i većina streptokoka, razgrađuju laktozu uz pomoć reakcije fosfoenol piruvata. Reakcija ovisi o sistemu fosfotransferaza (Postma i Roseman, 1976; Thompson, 1980). Unutar bakterijske stanice fosforilirani šećer razgrađuje se preko »tagatoza-6-P-ciklusa.«

Slika 1. Putevi fermentacije heksoza s bakterijama mliječno-kiselog vrenja (Kand le r, 1983)

Izostavljeno iz prikaza

Kod leukonostok vrsta fosforilirani šećer se vjerojatno transportira preko sistema permeaza (R o m a n o i sur., 1979). Laktoza se hidrolizira u glukozu i galaktozu djelovanjem B-galaktozidaze. Glukoza se metabolizira preko »fosfoketolaza ciklusa«, a galaktoza »Leloir ciklusa« (Ka n d 1 e r, 1983). Slika 2 prikazuje način upotrebe laktoze i galaktoze u streptokoka i laktobacila, a slika 3 metabolizam laktoze u leukonostoka.

GLUKOZA
FRU-1,6P
FRU-6P GK-6P
ACETIL-
P+ERITROZA-4
P-GLUKONAT
FRU-6P
HEPTOZA-P
PENTOZA-P
KSILULOZA-SP CO2
ACETIL-1P
TRIOZA-3P
TRIOZA-3P
TRIOZA-3P-ACETIL − P
ADP-AOP
ADP
ATP
PIRUVAT PIRUVAT g
PIRUVAT
LAKTOZA ACETAT
LAKTAT
LAKTAT ACETAT (ETANOL)
GLIKOLIZA
BIFIDOCIKLUS
GP-GLUKONATNI CIKLUS
FOSFOKETOLAZNl CIKLUS
(HOMOFERMENTACIJA)
( HETEROFERMENTACUA )
GALAKTOZA LAKTOZA
VANJSKI LAKTOZA GALAKTOZA
TAGATOZA − 6P
CIKLUS
LELOAR CIKLUS
GLIKOLIZA

Slika 2. Upotreba laktoze i galaktoze u laktobacila i streptokoka (K a n d 1 e r, 1983)

Izostavljeno iz prikaza

laktoza
β − galaktozidaza
glukoza
glukonat -6 P
ksiluloza 5P+CO-
trioza SP+ acetil − P
galaktoza
gaMP
glc

Slika 3. Metabolizam laktoze u leukonostoka (C o g a n, 1985)

Izostavljeno iz prikaza

PERMEAZE
FER MEASE
UNUTARNJI
LAKTOZA-1P
GLUKOZA-1P
LAKTOZA
GALAKTOZA
FOSFO-P
P—GALAKTOZIDAZA
GALAKT0Z10AZA
GAL-1P
TAG-6P
GLC-6P
GLC-1P
TAG-6P
KINAZA
RIOSETAG-1.6P
FRU-1.6P
PIRUVAT

Ako bakterije mliječne kiseline rastu u uvjetima ograničene količine glukoze ili laktoze, tada umjesto laktata proizvede druge produkte piruvatnog metabolizma kao npr. acetat, etanol, formijat. Prema tome, homofermentativ-.a rermentacija može prijeći u heterofermentativnu. Heterofermentativna fermentacija u bifidobakterija ili leukonostoka može prijeći u mješovitu kiselinsku fermentaciju (Kandler, 1983; Cogan, 1984).

Najvažnija metabolitička karakteristika .S. lactis subsp. diacetylactis je -potreba citrata kao izvora energije. .S. lactis razgrađuje citrat u CO2, acetat diacetil, acetoin i 2,3-butilen glikol. I leukonostoci mogu upotrebljavati citrat za svoj rast, a produkti metabolizma su diacetil, aceton i acetat. Navedeni produkti metabolizma tih vrsta bakterija važni su za određivanje okusa i mirisa fermentiranih mliječnih napitaka.

1.1.8. Metabolizam proteina u bakterija mliječno-kiselog vrenja

Bakterije mliječne kiseline slabi su proteoliti u usporedbi s ostalim bakte~jama. Međutim, njihov sistem proteinaza sastavljen je od većeg broja različitih proteinaza i peptidaza koje su smještene u staničnoj stijenci, staničnoj membrani i u citoplazmi. Neki od tih enzima izlučuju se kao slobodni enzimi izvan stanice.

Law i Kolstad (1983) opisali su proteolitične sisteme bakterija mliiečne kiseline i njihovu ulogu u prehrambenim proizvodima.

Stupanj proteolize koji se može postići fermentacijom mljekarskim kulturama od važnosti je i zbog toga što:

– oslobađanje peptida i aminokiselina može utjecati na konzistenciju proizvoda;
– mnoge aminokiseline koje se oslobađaju u procesu hidrolize proteina bitni su faktori rasta nekih kultura mikroorganizama;
– peptidi i aminokiseline su prekursori za mnoge reakcije u kojima se proizvode aromatične tvari.

1.2. Mezofilne kulture za fermentirane mliječne napitke

Općenito, mezofilne kulture bakterija mliječne kiseline razvijaju se pri temperaturama od 10 do 40°C, dok im je optimalna temperatura rasta oko 30°C. Također, mezofdni starteri u svom sastavu imaju N grupu streptokoka i ili leukonostoke. Ove starter-kulture upotrebljavaju se za proizvodnju kiselog vrhnja i maslaca kod kojih je proizvodnja diacetila od osobitog značaja. Različite vrste fermentiranih napitaka (koji se proizvode u različitim krajevima svijeta) proizvode se upotrebom mezofilnih kultura koje su sastavljene od streptokoka i leukonostoka ili ovi mogu biti u smjesi s ostalim bakterijama ili kvascima.

Važne karakteristike fermentiranih mliječnih napitaka proizvedenih upotrebom mezofilnih startera bakterija mliječne kiseline su: konzistencija (kao rezultat mliječno-kisele koagulacije proteina mlijeka), aroma i okus proizvedeni u procesu fermentacije laktoze i citronske kiseline (P e 11 e r s s o n, 1988).

Mezofilne kulture za proizvodnju fermentiranih mliječnih napitaka uglavnom su sastavljene od bakterija Streptococcus lactis, S. lactis subsp. cremoris, S. lactis subsp. diacetylactis i Leuconostoc lactis, L. mesenteroides subsp. cremoris, L. mesenteroides subsp. dextranicum. Prve dvije vrste S. lactis i S. lactis subsp. cremoris proizvode najviše kiseline od laktoze, dok S. lactis subsp diacetylactis i Leuconostoc spp. fermentiraju citronsku kiselinu i proizvock značajne metabolite kao što je CO2, acetaldehid i diacetil.

Mezofilne se kulture često dijele na više različitih tipova: s obzirom m svoj sastav (vrste i sojevi) ili prema aromatvornim bakterijama.

Mezofilne kulture koje u svom sastavu imaju S. lactis, i S. lactis subsp cremoris ili S. lactis subsp. diacetvlactis ili L. mesenteroides subsp. cremori: (a može i oba) uvrštavaju se u D-, L-(B) ili DL(BD) kulture. O-tip kulture nc sadrži aromatvorne bakterije.

Točan sastav nekih mezofilnih kultura često nije poznat. U mnogim kra jevima, osobito u Europi i Sjevernoj Americi, i sada se upotrebljavaju tradi cionalne kulture čiji je sastav nepoznat. Jedan od najvažnijih razloga za njiho vu primjenu je njihova manja osjetljivost prema bakteriofagima (S t a d h o u d e r s, 1975). Osim toga, simbiotski odnosi između vrsta i sojeva u tim kul turama čine ih veoma stabilnim. što je važno u proizvodnji fermentiranih mli ječnih napitaka (Reiter i Mpller-Madsen, 1963).

Kulture s određenim i poznatim šastavom, koje se danas većinom upotrebljavaju u proizvodnji sira, vjerojatno će se sve češće primjenjivati i u proizvodnji fermentiranih mliječnih napitaka.

Primjena kulture poznatog sastava također će olakšati komercijalizaciji genetički modificiranih sojeva (G as o n, 1983) i daljnji razvoj smrznutih ošušenih koncentriranih kultura.

Ponekad je veoma teško razlikovati vršte u saštavu mezofilnih kultura. 5 lactis subsp. diacetylactis na primjer razlikuje se u fenotipskoj karakteristici oc S. lactis šamo po tome što može fermentirati citrat. Mogućnošt transporta citrata u stanicu imaju sojevi koji imaju enzim citratnu permeazu. Enzim je kodiran pla/midom, koji se veoma lako gubi (Kempler i McKay, 1981) Ako se to dogodi, soj se veoma teško razlikuje od S. lactis.

U tablici 16 navedene su razlike između vrsta roda Streptococcus i Leuconostoc.

Tablica 16. Osobine i uloga mezofilnih bakterija mliječne kiseline (Cogan, 1983)

Izostavljeno iz prikaza

Bakterija Fermentacija šećera Tip mliječne kiseline Rast na lakmus mlijeku11
S. lactis šubsp. cremoris homo- L(+) RAC
S. lactis homo- L(+) RAC
S. lactis subsp. diacetvlactis homo- L(+) RAC
L. mesenteroides subsp. cremoris hetero- D RC
Bakterija Fermentacija šećera Tip mliječne kiseline Metabolizam citrata
S. lactis šubsp. cremoris homo- L(+) —
S. lactis homo- L(+) –
S. lactis subsp. diacetvlactis homo- L(+) -1-
L. mesenteroides subsp. cremoris hetero- D +
Bakterija Fermentacija šećera Tip mliječne kiseline NH3 od arginina
S. lactis šubsp. cremoris homo- L(+) —
S. lactis homo- L(+) +
S. lactis subsp. diacetvlactis homo- L(+) +(2)
L. mesenteroides subsp. cremoris hetero- D –
Bakterija Fermentacija šećera Tip mliječne kiseline Rast pri 40″C
S. lactis šubsp. cremoris homo- L(+) —
S. lactis homo- L(+) +
S. lactis subsp. diacetvlactis homo- L(+) +z
L. mesenteroides subsp. cremoris hetero- D _(3)
Bakterija Fermentacija šećera Tip mliječne kiseline Funkcija u kulturi
S. lactis šubsp. cremoris homo- L(+) kiselina
S. lactis homo- L(+) kiselina
S. lactis subsp. diacetvlactis homo- L(+) kišelina
+ aroma
L. mesenteroides subsp. cremoris hetero- D aroma

(1) R = redukcija; A = proizvodnja kiseline; C = koagulacija
(2) veći broj sojeva ne proizvodi NH3 od arginina
(3) pri 39°C

1.2.1. Neka posebna i tehnološka svojstva mezofilnih kultura

Proizvodnja mliječne kiseline

Najvažnije svojstvo bakterija mliječne kiseline u starteru je proizvodnja mliječne kiseline od laktoze. Streptbkoki u mlijeku proizvode 0,5 do 0,7% mliječne kiseline, a leukonostoci 0,1 do 0,2% ( S p i 11 m a n , 1982).

Mezofilne kulture zaustavljaju fermentaciju pri pH 4,3 do 4,5.

Proteolotično djelovanje

Za svoj rast streptokoki i leukonostoci trebaju neke aminokiseline iMills i T h o m a s, 1981). Proteolitični enzimi streptokoka i leukonostoka važni su zbog »obrade« mlijeka u svrhu njegove upotrebe za bolji rast bakterija (Pettersson, 1988). Mlijeko, inače, sadrži samo male količine slobodnih aminokiselina i peptida, koje variraju tijekom godišnjih doba, načina skladištenja i dr. (R e n n e r, 1974).

Streptokoki imaju proteolitične enzime, (proteinaze i peptidaze) koji se nalaze u različitim dijelovima stanice. Leukonostoci slabije rastu u mlijeku ako i-astu kao pojedinačni sojevi. U miješovitim starter kulturama rast leukonostoka stimuliraju hidrolizirani proteini pripremljeni preko proteolitične aktivnosti S. lactis i S. lactis subsp. cremoris. Ovaj podatak dokazuje da leukonostoci nemaju potrebne proteolitične enzime.

Kod mnogih su streptokoka proteinaze kodirane plazmidom koji se može izgubiti. Gubitak plazmida uzrok je »sporoj koagulaciji (Klaenhammer i sur., 1978).

Lipolitično djelovanje

Streptokoki mliječne kiseline imaju veoma slabu lipolitičnu aktivnošt Stadhouderš i Veringa, 1973).

Fermentacija citronske kiseline

Diacetil i CO2, veoma su važni metaboliti biokemijške aktivnošti bakterija mliječno-kiselog vrenja, jer sudjeluju u tvorbi i oblikovanju arome fermentiranih mliječnih napitaka. S. lactis subšp. diacetylactis i Leuconostoc spp. iz šaštava mezofilnih kultura fermentiraju citronsku kiselinu i proizvode aromatične tvari. Jedan dio CO, proizvodi se i u heterofermentativnoj fermentaciji laktoze leukonoštocima. Žnatan broj radova i autora proučavao je fermentaciju citronske kiseline djelovanjem štreptokoka i leukonoštoka (Collinš, 1972; Drinan i sur., 1976; Kempler i McKay, 1981), ali još uvijek poštoje šuprotna mišljenja i nije utvrđen točan mehanizam (V e r i n g a i sur., 1984) za taj proces.

Sluzavost

Streptokoki mliječne kiseline koji su sposobni proizvoditi sluz vrlo su važni za proizvodnju nordijskih vrsti fermentiranih mliječnih napitaka kao što je švedski »langfil« i finski »viili«. Sluzotvomi sojevi vrsta S. cremoris i S. lactis proizvode u mlijeku supstancu sličnu glikoproteinu, čija kemijska struktura još nije poznata (Macura i Townsley, 1984).

Prema McKay (1983) i Vadamuthu i Nevilleu (1986), sluzavost nekih sojeva je kodirana plazmidom, pa se time objašnjava gubitak te sposobnosti kod nekih sojeva iz starter kultura.

Inhibitorne tvari što ih proizvode mezofilne kulture

Mezofilni streptokoki i leukonostoci proizvode različite inhibitome tvari koje mogu utjecati na rast sporogenih i patogenih mikroorganizama, ali i na rast ostalih sojeva iz sastava mješovitog startera. Na taj si način sojevi koji tvore inhibitorne tvari osiguravaju prevlast u mljekarskoj kulturi ( H u g e nholtz, 1986). Uz inhibitarno djelovanje navedenih tvari, inhibicija rasta može biti rezultat natjecanja za esencijalne tvari rasta u podlozi ili snižavanje pH-vrijednosti. Inhibitome tvari koje proizvode mezofilne bakterije mliječne kiseline mogu biti: mliječna kiselina, H2O2, hlapljive kiseline i tvari poput antibiotika.

Ostali metaboliti kao npr. D-leucin, također mogu imati antagonističku ulogu (Gilliland i Speck, 1968). U procesima proizvodnje fermentiranih mliječnih proizvoda u mnogo slučajeva inhibicija se ne može objasniti djelovanjem samo jedne tvari. Inhibicija je najčešće rezultat više faktora: niska pH-vrijednost podloge, oksido-redukcijski potencijal, H2O2, antibiotici i natjecanje za hranjive tvari (Petterson, 1988). Od antibiotika i antibioticima sličnih tvari, nisin je prvi otkriveni i proučeni antibiotik koji proizvode streptokoki mliječne kiseline (Mattick i Hirsch, 1944; Hurst, 1981). Proizvode ga neki sojevi S. lactis, a često se upotrebljava u prehrambenoj industriji.

1.2.2. Faktori koji utječu na rast i aktivnost mezofilnih kultura

Aktivnost bakterija u sastavu mezofilnih kultura, koja je vrlo često povezana i s njihovim rastom, ovisi o više faktora, a najvažniji od njih su:

– nasljedne osobine
– utjecaj mlijeka kao hranjive sredine (hranjive tvari, tvari stimulacije i inhbicije rasta)
– bakteriofagi i
– ostali uvjeti rasta.

Za svoj razvoj mezofilni streptokoki mliječne kiseline zahtijevaju vrlo kompleksan sastav hranjive podloge. Mliječni šećer je za njih najvažniji izvor ugljika u mlijeku. U mezofilnim mliječno-kiselim fermentacijama potroši se samo 20 do 30% mliječnog šećera (A1 m, 1982).

Mezofilni streptokoki mliječno-kiselog vrenja imaju vrlo različite potrebe za aminokiselinama. Količina slobodnih aminokiselina u mlijeku je neznatna, 50 do 80 mg/l (R e n n e r, 1974). No, većina mliječnih streptokoka luči proteolitične enzime pa može iskorištavati mliječne bjelančevine, osobito kazein.

Od vitamina potrebnih za rast mezofilnih bakterija mliječne kiseline treba istaknuti vitamine B skupine. S. lactis, S. lactis subsp. cremoris i S. lactis subsp. diacetylactis za svoj rast zahtijevaju pantotensku kiselinu, niacin i biotin, a neki sojevi trebaju i riboflavin i tiamin (R e i t e r i O r a m, 1962).

Mlijeko sadrži sve esencijalne mineraie potrebne za njihov rast, ali ne uvijek u optimalnim koncentracijama. Za rast mezofilnih streptokoka i leuko.ostoka važni su ovi minerali: Fe, Mg, Mo, Zn, Co, Ca, K, Na, Se, Va i Mn Petterson, 1988).

Mlijeko sadrži i ostale tvari koje su stimulatori rasta, kao purinske i pirimidinske baze i njihove derivate (Talburt i Ratliff, 1981). Rast nekih sojeva u sastavu mezofilnih mljekarskih kultura stimulira CO2, osobito u poćetnoj fazi rasta (S t a d h ou d e r s, 1974).

Tablica 17. Inhibitorni učinak nekih sredstava za dezinfekciju na mezofilne mljekarske kulture (Pettersson, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Dezrnficijens Inhibitomi učinak − aktivna tvar (mg/1)
slab
kloridi 5 do 30
oarteme amonijeve soli 0,1 do 2
H2O2 1 do 5
jodidi 10 do 50
Tego 51 1 do 10
Dezrnficijens Inhibitomi učinak − aktivna tvar (mg/1)
izrazit
kloridi 25 do 760
oarteme amonijeve soli 25 do 100
H2O2 120 do 150
jodidi 50 do 100
Tego 51 100

Tablica 18. Količine antibiotika koje inhibitorno djeluju na mezofilne mljekarske kulture

Izostavljeno iz prikaza

Antibiotik Mljekarska kultura
tetraciklin kultura za maslac
oksitetraciklin kultura za sir,
razne DL kulture
klortetraciklin 5. lactis,
kultura za maslac
kultura za sir
streptomicin kultura za maslac,
kultura za sir
bacitracin kultura za maslac
kloramfenikol kultura za maslac,
kultura za sir,
različite DL-kulture
penicilin kultura streptokoka mliječne kiseline,
kultura leukonostoka
teramicin različite DL-kulture
sulfanilamidi različite DL-kulture
Antibiotik Inhibitorna koncentracija ( g/ml)
tetraciklin 0,01 do 0,1
oksitetraciklin 0,01
0,01 do 0,05
klortetraciklin < 0,05
0,01 do 0,1
0,01 do 1,0
kloramfenikol 0,1 do 0,2
0,02
0,02 do 0,05
penicilin 0,0017 do 0,1<0
teramicin 0,01 do 0,05
sulfanilamidi 10,0

11) internacionalne jedinice za penicilin

Toplinskom obradom mlijeka namijenjenog proizvodnji mljekarskih kultura ili proizvodnji fermentiranog mlijeka oslobađaju se SH-skupine koje djeluju stimulativno na rast bakterija mlječnokiselog vrenja (Hemmingson i Kosikowski, 1957).

Tvari koje inhibiraju rast mikroorganizama u mlijeku mogu se podijeliti na tvari prirodno sadržane u mlijeku i one koje su u nj nehotice dospjele. Prirodno sadržane inhibitorne tvari su laktoperoksidaze, imunoglobulini, laktoferin i lizozim. Utjecaj tih tvari na rast mezofilnih bakterija mliječno-kiselog vrenja nije sasvim istražen (R ei t e r, 1973).

Najčešće nehotično dospjele inhibitorne tvari u mlijeku su: dezinficijensi i antibiotici. U tab. 17 su podaci o inhibitomom učinku nekih dezinficijenata na mezofilne mljekarske kulture.

Mezofilni streptokoki i leukonostoci vrlo su osjetljivi prema djelovanju mnogih antibiotika koji se upotrebljavaju u proizvodnji mlijeka (odnosno u liječenju upala vimena mliječnih krava). U tab. 18 su podaci o količini različitih antibiotika koji inhibitorno djeluju na neke mezofilne mljekarske kulture (Marth i Ellickson, 1959; Cogan, 1972; Orberg i Sandine, 1985.).

Bakteriofagi

Bakteriofagi su velika opasnost za mljekare, jer su uzrok sporog kiseljenja mlijeka ili njegova posvemašnjeg izostanka. Kontrola fermentacije (da ne nastupe promjene kakvoće proizvoda) može se provoditi upotrebom genetički postojane mješovite kulture poznatih sojeva bakterija otpornih prema bakteriofagima u kombinaciji s protektorima za proizvodnju mljekarskih (tehničkih) kultura i upotrebom hranjivih podloga za njihov uzgoj s inhibitomim učinkom na fage (D a 1 y, 1983).

Međusobno djelovanje bakterija mliječno-kiselog vrenja i faga istražuje se posljednjih 50 godina. Većina istraživačkih radova odnosila se na mezofilne streptokoke mliječne kiseline (Lawrence, 1978; Lembke i sur., 1980; Teuber i Lembke, 1983; Klaenhammer, 1984).

Ustanovljena je i osjetljivost leukonostoka prema bakteriofagima (S o zz i i sur., 1978).

U streptokoka mliječno-kiselog vrenja fag se različito veže na domaćina (Klaenhammer, 1984). Adsorpcija faga, prodor fagove DNK u bakterijsku stanicu, umnožavanje (replikacija), transkripcija i proizvodnja novih čestica faga u bakterijskoj stanici uzrok su lize stanice, a to je ciklus koji uzrokuje mnoge nevolje u nesmetanom tijeku fermentacije u mljekarama.

Opasnost od lize stanica zaraženih fagom ovisi o jačini infekcije (titar faga) i latentnom razdoblju (vremenskom razmaku proteklom od infekcije do lize) što može kolebati od 9 do 139 min (Klaenhammer, 1984), odnosno o broju čestica faga stvorenih u bakterijskoj stanici što može kolebati od 9 do 105 čestica (Koegh, 1973).

U sastavu mljekarskih kultura vrlo česti su lizogeni mezofilni streptokoki (T eu b e r i Lemke, 1983). Liza se u lizogenim kulturama može inducirati na nekoliko načina: UV-svjetlost, mitomicin C, toplina ili spontano (Teuber i Lembke, 1983).

Uobičajeni postupci sprečavanja razvoja bakteriofaga obuhvaćaju uzgoj mljekarskih kultura u podlogama koje sadržavaju inhibitorne tvari za fage Sandine, 1977), aseptičko nacjepljivanje (inokulaciju) podloga i aseptičku opremu za uzgoj mikrobnih kultura (Sandine, 1977), upotrebu koncentriranih kultura (S a n d in e, 1977) i mijenjanje (rotaciju) proizvodnih sojeva (Whitehead, 1953; Stadhouders, 1986). Nove mogućnosti sprečavanja razvoja faga očekuju se od genetičkog inženjerstva, tj. proizvodne sojeva otpomih prema fagima i također od proučavanja fag-obrambenih mehanizama.

Prema podacima Lawrencea i Thomasa (1979) razabire se da će nevolje s fagima u uzgoju mezofilnih i termofilnih mljekarskih kultura biti nevolje budućnosti«, jer se opseg proizvodnje mliječnih proizvoda neprestano povećava.

Na rast i djelovanje mezofilnih bakterija mliječno-kiselog vrenja utječu pH. oksido-redukcijski potencijal i međusobni odnosi sojeva u mješovitim mljekarskim kulturama. lako pH-vrijednost mlijeka koleba od 6,4 do 6,8 već i male promjene pH-vrijednosti jako utječu na ošebujan rast štreptokoka mliječne kiseline u mlijeku (H a r v e y, 1965).

H2O2 može inhibirati rast i proizvodnju kiseline nekih bakterijških sojeva u mljekarskoj kulturi (Anderš i sur., 1970). U mješovitim kulturama sastavljenim od više vršta) međusobno djelovanje može biti inhibitorno ili stimulativno, pa ono može biti odlučno za poštojanošt mljekarske kulture. Prema nekim radovima (O lš o n, 1960; Dahiya i Speck, 1963) poticajne tvari između podvršte S. lactis subsp. cremoris i vrste S. lactis češto su derivati nukleinskih kiselina. Rast leukonoštoka u mješovitim kulturama potiču tvari što ih tvore S. lactis ili S. lactis subšp. cremoris (G o e 1 i Marth, 1971).

Inhibitorne tvari u mješovitim kulturama najčešće su H2O2 i različiti -akteriocidi (Anderš i sur., 1970).

1.3. Termofilne kulture za proizvodnju fermentiranih mliječnih napitaka

Optimalna temperatura rasta termofilnih kultura mliječno-kiselog vrenja je 37 do 45°C. Ovi starteri proizvode mliječnu kiselinu brzo i pri višim temreraturama nego mezofilni starteri (R o b i n s o n, 1983).

Termofilne kulture upotrebljavaju se za proizvodnju jogurta i sličnih vrsti fermentiranih mliječnih napitaka, a sastavljene su od laktobacila i streptokoka.

Kulture za proizvodnju jogurta

Za proizvodnju jogurta upotrebljava se kultura sastavljena od bakterija 5. thermophilus i L. delbrueckii subsp. bulgaricus, koje u mlijeku rastu u simbiozi. Količina proizvedene mliječne kiseline veća je kod zajedničkog rasta te dvije bakterije nego svake bakterije posebno. Na slici 4 prikazana je količina proizvedene mliječne kiseline u toku fermentacije mlijeka pri 40 °C djelovanjem kulture za jogurt i pojedinačnih bakterija iz sastava kulture.

Slika 4. Razvoj mliječne kiseline djelovanjem pojedinačnih bakterija i starter-kulture za jogurt u toku inkubacije u autoklaviranom obranom mlijeku pri 40 C (T a m i m e, 1977)

Izostavljeno iz prikaza

mješovita kultura
S. thermophilus
T. bulgaricus
vrijeme inkubacije, h

Iz rezultata većeg broja radova koji se odnose na simbiozu bakterija u sastavu jogurtnog startera (Shanker, 1977; Bracquart i sur., 1978; Bacquart i Lorient, 1979) vidi se da L. delbrueckii subsp. bulgaricus stimulira rast S. thermophilus preko nekih aminokiselina (histidin, leucin, lizin, cistin, valin i dr.) koje proizvodi tijekom svog rasta. S. thermophilus, prema istim autorima, pomaže rast L. delbrueckii subsp. bulgaricus, proizvodeći sastojke slične mravljoj kiselini.

Prema Tamimu i Robinsonu (1985) stimulatori rasta jogurtne kulture mogu biti i: peptidi, purini, pirimidini, oksaloctena kiselina, mono i dinatrijum ortofosfat, denaturirani sirutkini proteini te djelomično hidrolizirani kazein. Dokazano je da i S. thermophilus proizvodi dovoljne količine CO2 koje stimuliraju rast L. delbrueckii subsp. bulgaricus.

Slika 5 prikazuje metabolizam bakterija S. thermophilus i L. delbrueckii subsp. bulgaricus u mlijeku (D r i e s s e n i sur., 1982).

Izostavljeno iz prikaza

P
mlječna kiselina
mravlja kiselina
mali peptidi + aminokiseline
4 mg O2/kg
CO2
ograničeni rast
S. thermophilus
Lactobacillus bulgaricus
laktozaSlika 5. Metabolizam bakterija S. thermophilus i L. delbrueckii subsp. bulgaricus u mlijeku (D r i e s s e n i sur., 1982)

Izostavljeno iz prikaza

(P) proizvodnja;
stimulacija; — inhibicija

Pojedinačni sojevi iz jogurtne kulture razvijaju se pri različitim optimalnim temperaturama, ali se za zajednički rast u mlijeku preporučuje temperatura od 42°C uz dodatak 2% inokuluma koji sadrži obje vrste bakterija u odnosu 1 : 1 (Tamime 1977).

Slika 6 prikazuje utjecaj temperatura inkubacije na broj koka i štapića u mješovitoj kulturi za jogurt, a slika 7 razvoj kiselosti u ovisnosti o postotku dodanog cjepiva. U slici 8 je elektronska fotomikrografija kulture za jogurt.

Slika 6. Utjecaj temperature inkubacije na broj koka i štapića u mješovitoj kulturi za jogurt

Izostavljeno iz prikaza

Slika 7. Razvoj kiselosti mješovite kulture za jogurt u ovisnosti o postotku dodanog cjepiva

Izostavljeno iz prikaza

Slika 8. Elektronska fotomikrografija mješovite kulture za jogurt

Izostavljeno iz prikaza

Za proizvodnju startera općenito, pa tako i jogurtnog startera, mlijeko se grije zbog uništavanja nepoželjnih mikroorganizama, zbog promjena proteina mleka koji postaju bakterijama lakše dostupni za upotrebu, da se reducira količina H2O2, da se unište različiti prirodni inhibitori prisutni u sirovom mlimleku i nastane mravlja kiselina koja stimulira rast laktobacila (Auclair, 1954).

Starteri za proizvodnju jogurta veoma su osjetljivi na različite inhibitorne tvari pnrodno prisutne u mlijeku ili one koje su nehotice dospjele u mlijeko. Pnrođno prisutne inhibitome tvari u mlijeku kao laktenini, peroksidaze, aglutenini i inhibitome tvari iz pljesnive silaže (Dellaglio, 1988) mogu inhibirati bakterije mliječno-kiselog vrenja, pa tako i termofilne startere.

Zaostaci kemikalija i antibiotika u mlijeku jako utječu na razvoj jogurtnog startera, tako da ometaju simbiotičke odnose u kulturi ili uzrokuju smanjenu količinu proizvedene mliječne kiseline. Monokulture su osjetljivije na djelovanje ovih tvari od miješovitih kultura. U tablici 19 nalaze se podaci o osetljivosti jogurtnih kultura prema različitim supstancama (Tamime i Robison, 1985.

Tablica 19. Osjetljivost jogurtnih starter kultura prema različitim tvarima koje mogu biti prisutne u mlijeku (Tamime i Robinson, 1985)

Inhibitoma tvar
Količina inhibitora

S. thermophilus
I Antibiotici (po ml)
Peniciiin 0,004-0,010 I.U.
Streptomicin 0,380 I.U.
Streptomicin 12,5-21,0 μg
Tetraciikin 0,130-0,500 μg
Klortetraciklin 0,060-1,000 μg
Oksitetraciklin 0,400 I.U.
Bacitracin 0,040-0,120 I.U.
Eritromicin 0,300-1,300 mg
KJoramfenikol 0,800-13,00 mg
II Dezinficijensi/detergenti (mg/1)
Kloridi 100
Kvarterne amonijeve soli 100-500
Amfoliti
Jodofor 60
Alkalni detergenti
III Različite tvari (ppm)
Masne kiseline 1000
Metilsulfon 10-100
Kloroform 10
L. delbureckii subs. bulgaricus
1 Antibiotici (po ml)
Peniciiin 0.02-0.100 l.U.
Streptomicin 0.380 I.U.
Streptomicin 6,6 μg
Tetracilkin 0,34-2,00 μg
Klortetraciklin 0,060-1.00 μg
Oksitetraciklin 0,700 I.U.
Bacitracin 0,040-0,100 I.U
Eritromicin 0,070-1,300 mg
Kloramfenikol 0,800-13,00 mg
II Dezinficijensi/detergenti (mg/1)
Kloridi 100
Kvarterne amonijeve soli 50-100
Amfoliti
Jodofor 60
Alkalni detergenti
III Različite tvari (ppm)
Masne kiseline
Metilsulfon
Kloroform
Mješovita kultura
1 Antibiotici (po ml)
Peniciiin 0,01 I.U.
Streptomicin 1,00 l.U.
Streptomicin –
Tetraciikin 1,00 I.U.
Klortetraciklin 0,10 I.U.
Oksitetraciklin 0,40 I.U.
Bacitracin 0,040 I.U.
Eritromicin 0,10 I.U.
KJoramfenikol 0.50 I.U.
II Dezinficijensi/detergenti (mg/1)
Kloridi 50 >2500
Kvarterne amonijeve soli >250
Amfoliti >1000
Jodofor >2000
Alkalni detergenti > 50-1000
III Različite tvari (ppm)
Masne kiseline
Metilsulfon

i U = intemacionalna jedinica; ppm = parts per miilion

Termofilne kulture mliječno-kiselog vrenja su, kao i većina laktobacila, mikroaerofilne. Ta spoznaja je važna zbog upotrebe svježe zagrijanog mlijeka pri proizvodnji startera, jer se grijanjem reducira količina kisika u mlijeku.

Termofilne kulture mliječno-kiselog vrenja posjeduju proteolitične enzime i ta važna aktivnost treba se kontrolirati ili poboljšati ispravnim omjerom količine koka prema štapićima. Kvaliteta mlijeka ima važnu ulogu za rast i aktivnost termofilnih startera. Tako su npr. maštitis, proteolitična aktivnost psihrotrofnih bakterija i različiti način išhrane muzne stoke samo nekoliko važnih činilaca koji utječu na rast bakterija (D e 11 a g 1 i o, 1988).

Bakteriofagi mogu djelovati štetno na kulture za proizvodnju jogurta, a i uništiti ih. Za bolju kontrolu i borbu protiv bakteriofaga važno je, prema navodima Tamima i Robinsona (1985), znati slijedeće: toplinska obrada mlijeka na 85 °C kroz 20 min uništit će prisutne fage; optimalna temperatura za razvoj faga je jednaka optimalnoj temperaturi rasta bakterije domaćina; (dakle, fag je špcifičan za određeni bakterijski soj); kemijska šredstva (kao 0,1% kvarternih amonijevih soli, 70-90%-tni etanol, 0,5—1% kalijev permanganat ili 50-100 mg/l aktivnog klora) uništavaju fage bakterije 5. thermophilus.

Prema navodima Klaenhammera (1984) problem faga nikada se neće sasvim riješiti. Međutim, infekcije fagom reducirat će se na najmanju moguću mjeru kad se detaljno prouči obrambeni mehanizam faga, blokiranje adsorpcije faga, toplinska ošjetljivost faga. Dobiveni podaci omogućit će proizvodnju fag rezistentnih kultura (D e 11 a g 1 i o, 1988).

Biotehnološka aktivnost termofilnih kultura

Termofilne kulture proizvode veliku količinu mliječne kiseline. L. delbrueckii subsp. bulgaricus proizvodi u mlijeku od 1,7 do 1,8% mliječne kiseline, dok 5. thermophilus proizvodi od 0,6 do 0,8%.

Mliječna kiselina veoma je važna u proizvodnji jogurta i jogurtu sličnih fermentiranih mlijeka. Prema Tamimu i Robinšonu (1985) mliječna kiselina šudjeluje u oblikovanju gel strukture proizvoda promjenom koloidalnog kalcij/fosfat kompleksa (koji je sastavni dio micela kazeina) u topljivu kalcij/fosfatnu frakciju. U tom procesu izdvaja se kalcij iz micela i to je razlog koagulacije kazeina kod 4,6 do 4,7 pH-vrijednosti. Mliječna kiselina koju proizvode termofilne kulture daje jogurtu karakterističan i kiseo okus.

Prema Garviu (1978), Hemmu i sur. (1981), S. thermophilus proizvodi L(+) mliječnu kiselinu, a L. delbrueckii subsp. bulgaricus uglavnom D(-) mliječnu kiselinu (Tamime i Deeth, 1980). Tako jogurt najčešće sadrži 45-60% L(+) mliječne kiseline i 40-55% D(-) mliječne kiseline (P uhan i sur., 1974). Blumental i Helbling (1973) su sugerirali da je za »dobar jogurt« potrebno da omjer između L(+) i D(-) iznosi 1:1. Prema Kunathu i Kandleru (1980), različiti omjer između koka i štapića ili niža temperatura fermentacije (ispod 40° C) može šniziti kiselošt proizvoda, pa će jogurt sadržavati više od 70% L(+) mliječne kiseline. Nasuprot tome više štapića u starteru i viša temperatura inkubacije (45° C) uzrokuju kiseliji proizvod i s više D(-) mliječne kiseline.

Slika 9 prikazuje proizvodnju mliječne kiseline u jogurtu tijekom fermentacije i skladištenja pri različitim temperaturama.

42 °C L(-) 25 °C L( + )
5 °C L(-) 22 °C D(-)
4 °C D(-)
koagulacija
mlječna kiselina

Slika 9. Proizvodnja mliječne kiseline u jogurtu tijekom fermentacije i skladištenja pri različitim temperaturama (Kunath i Kandler, 1980)

Izostavljeno iz prikaza

Naknadno kiseljenje proizvoda zbog proizvodnje organskih kiselina djelovanjem termofilnih kultura u periodu od završene proizvodnje do potrošnje anra od šoja do soja. Na naknadno kiseljenje utječe više činilaca: krajnji pH proizvoda (najniži pH), temperature skladištenja i distribucije, genetička svojstva sojeva iz šastava startera (K u r m a n, 1983).

Tipična aroma fermentiranih mliječnih napitaka potječe uglavnom od ,ešavine mliječne kiseline i karbonilnih špojeva. Međutim, na aromu jogurta mogu utjecati i slijedeći sastojci: nehlapljive kiseline (piruvat, oksalna i jantarna kiselina), hlapljive kiseline (mravlja, octena, propionska), tvari koje se oslobađaju pri toplinskoj razgradnji proteina, mašt ili laktoza. Količina proizvedenih karbonilnih špojeva u mlijeku fermentacijom pojedinačnih sojeva i mješoite kulture različita je, što se vidi u tablici 20.

kulture Acetaldehid
S. hermophilus 1,0-8,3
L. Lelbrueckii subsp. bulgaricus 1,4-12,2
Mješovita kultura 2,0-42,0
kulture Aceton
S. hermophilus 0,3-5,2
L. Lelbrueckii subsp. bulgaricus 0,3-3,2
Mješovita kultura 1,3-4,0
kulture Acetoin
S. hermophilus 1,7-7,0
L. Lelbrueckii subsp. bulgaricus tragovi-2,0
Mješovita kultura 2,2-5,7
kulture Diacetil
S. hermophilus 0,1-13,0
L. Lelbrueckii subsp. bulgaricus 0,5-13,0
Mješovita kultura 0,4-0,9

Tablica 20. Proizvodnja karbonilnih spojeva (ppm) fermentacijom mlijeka jogurtnim kulturama (Tamime i Robinson, 1985)

Izostavljeno iz prikaza

Mnogi istraživači kao Pette i Lolkema (1950), Hamdan i sur. (1971), Bottazzi i Vescovo (1979) i drugi, utvrdili su da je svojstvena aroma jogurta direktno vezana uz karbonilne spojeve, posebno acetaldehid. Rezultati više radova (G o r n e r i sur., 1968; Abrahamsen i sur., 1978) ukazali su da povećanje suhe tvari mlijeka, toplinska obrada osnovne sirovine, mlijeko različitih vrsta, mogu utjecati na količinu i tip karbonilnih spojeva u proizvodu.

Konzistenciju jogurta moguće je stabilizirati ukoliko kultura sadrži i sojeve koji proizvode polisaharide. Prema literatumim podacima sluzne supstance proizvode neki sojevi bakterija 5. thermophilus i S. delbrueckii subsp. bulgaricus (Tamime, 1977; Tamime i Robinson, 1978). Nije još sasvim utvrđeno kako se odvija biosinteza polisaharida u tim bakterijama, međutim prisutnost mukoidnih supstanci poboljšava konzistenciju proizvoda.

Podaci iz rada Grouxa (1972) pokazuju da termofilne kulture svojom biokemijskom aktivnošću povećavaju količinu topljivog kazeina i slobodnih aminokiselina i vjerojatno poboljšavaju međusobne simbiontičke odnose.

Prema Tamimu i Robinsonu (1985), proteolitična aktivnost jogurtnih srartera je promjenljiva i ovisi:

– aktivnost je maksimalna u logaritamskoj fazi rasta;
– aktivnost slabi tijekom skladištenja, nakon stacioname faze;
– omjer S. thermophilus i L. delbrueckii subsp. bulgaricus utječe na količinu aminokiselina u jogurtu (kod odnosa 1 : 1 udio je 70 g g, a sa 2 : 1 udio je 41 p g); veća količina aminokiselina povezana je s većom aktivnosti L. delbrueckii subsp. bulgaricus koji u jogurtu s povišenom kiselošću pokazuje i veću proteolitičnu aktivnost;
– vrste aminokiselina u jogurtu mijenjaju se u toku 24 sata čuvanja proizvoda s obzirom na odnos koki: štapići;
– hidroliza sirutkinih proteina je slabija kada u kulturi brojčano prevladavaju koki;
– slobodne masne kiseline mogu umanjiti proteolitičnu aktivnost i poboljšavaju konzistenciju koaguluma;
– jaka proteolitična aktivnost utvrđena je pri proizvodnji jogurta od laktoza − hidroliziranog mlijeka;
– gorke peptide proizvodi L. delbrueckii subsp. bulgaricus.

Vrst i količina N-tvari u jogurtu proizvedenih proteolitičnom aktivnošću termofilnih startera ovisi o: selekciji sojeva u starteru, tipu mlijeka (kravlje, ovčje, kozje), primijenjenom tehnološkom postupku, omjeru koka i štapića u kulturi, načinu skladištenja, količini mliječne kiseline u jogurtu (R a š i ć i sur. 1971; Tamime i Deeth, 1980).

Termofilne kulture mliječno kiselog vrenja mogu imati i lipolitičnu aktivnost. L. delbrueckii subsp. bulgaricus proizvodi više masnih kiselina od S. thermophilus.

Proizvodnja, iako malih količina, hlapljivih masnih kiselina u jogurtu ovisi o odabranim sojevima u kulturi, vršti upotrijebljenog mlijeka, temperaturi i vremenu inkubacije, štarošti jogurta i toplinskoj obradi mlijeka (N a k an i š h i, 1975; Singh i sur., 1980).

Općenito lipolitična aktivnost termofilnih kultura je slaba (S h a h a n i i sur. 1974).

Tijekom svog rasta bakterije iz sastava jogurtnog startera troše ili sintetiziraju vitamine. Prema Deethu i Tamimu (1981) u toku proizvodnje jogurta sintetizira se niacin i folna kiselina, vjerojatno i vitamin B6 i B12. Černa i sur. (1973) zapazili su da se količina biotina, niacina, folne kiseline vitamina B12 smanjuje pri dugom hladnom skladištenju proizvoda.

Mnogi radovi (Shahani i sur., 1976, 1977; Pulusani i sur., 1979) − kojima se proučava metabolizam termofilnih mikrobnih kultura, pokazuju bakterije mliječne kiseline .S. thermophilus i L. delbrueckii subsp. bulgariproizvode antimikrobne tvari, vrlo aktivne u odnosu na gram-pozitivne i gram-negativne bakterije. Te su tvari otporne prema toplini, imaju molekularnu − masu manju od 700 daltona, a njihova proizvodnja koleba s obzirom na hranjivu podlogu i upotrebljeni soj (D e l l a g I i o, 1988). Neki sojevi podvrste L delbrueckii subsp. bulgaricus proizvode bakteriocin koji se naziva »bulgankan« (Reddy i Shahani, 1971; R e d d y i sur., 1983).

1.4 Kulture za proizvodnju kefira i kumisa

U Rusiji i nekim azijskim zemljama neki od fermentiranih mliječnih napitka proizvode se upotrebom prirodne mikroflore koja sadrži kvasce kao najvažnije mikroorganizme u sastavu. Ti se proizvodi bitno razlikuju od industrijski proizvedenih (primjenom čistih kultura) po svojim fizikalno-kemijkim mikrobiološkim i biološkim svojstvima (K o r o 1 e v a, 1988). Za kvasce koji su izolirani iz tradicionalno proizvedenih proizvoda utvrđeno je da imaju visoku antibiotsku aktivnost u odnosu na uzročnika tuberkuloze (S k o r o d um o v a. 1954; Khrisanfova, 1969) i na koliformne bakterije (I v a n ova. 1975).

Također, navodi K o r o 1 e v a (1982), kefir ima visoku nutritivnu, biološku i dijetetsku vrijednost, pa se podjednako može preporučiti zdravim osobama kao i osobama koje imaju probavne smetnje, poteškoće s visokim tlakom i alergjje.

1.4.1. Kulture za proizvodnju kefira

Kefirje veoma popularan u Rušiji, a proizvodi se i u Čehošlovačkoj, Poljskoj, Svedskoj i drugim zemljama. Tehnološki poštupak proizvodnje i kulture različiti su, pa i kvaliteta proizvoda jako varira ( tab. 21).

Kultura za proizvodnju kefira najčešće se dobiva inkubacijom kefirnih zrnaca u mlijeku. Ovako proizvedeni starter upotrebljava se i za domaću i za industrijsku proizvodnju.

Kefirna zrnca karakterizira neujednačeni oblik, nabrana ili hrapava površina, bijela ili svijetložuta boja. Zrnca su elastična i specifičnog kiselog okusa. Promjer zrnca može biti 1-6 mm, pa i više. Aktivna kefirna zrnca plutaju na površini mlijeka. Zrnca su rezultat jake i specifične simbioze i uvijek imaju određenu strukturu, ona rastu i umnožavaju se, a svoja svojstva prenose novoj generaciji tj. novim kefirnim zrncima (K o r o l e v a, 1988).

Tablica 21. Faktori koji utjeću na kakvoću kefira (K o r o l e v a, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Proizvodni postupak

mlijeko
↓
suha tvar mlijeka
bez masti
↓
homogenizacija
↓
pasterizacija
↓
cijepljenje i temperature
pasterizacije
↓
mikrobna kulturaM
↓
trajanje fermentacije
↓
kiselost nakon fermentacije
↓
miris i aroma
↓
konzistencija
↓
skladištenje

Povoljni učinak

dobra kakvoća 8%
12,5 do 17,5 MPa
85 do 87 °C 5 do 10 min
90 do 95 °C, 2 do 3 min
22 do 25 °C
8 do 12 sati
36 °SH do 40 SH
zrenje tijekom sporog hlađenja 8
do 12 sati
umjerena mehanička obrada gruša,
skladištenje pri 6 do 8 C nakon
punjenja u ambalažu
8 °C

Nepovoljni učinak

strani okus/miris
< 85 °C i < 10 min
< 90 °C i < 2 min > 25 °C
< 8 sati
< 36 °SH do 40 °SH >
brzo hlađenje
snažno miješanje gruša
> 8 °C

(x) MK-1 =mikrobna kultura (»starter« 1) pripremljena izravno od kefimih zrnaca;
MK-2 = mikrobna kultura (»starter« 2) pripremljena precjepljivanjem MK-1

Mikroflora kefirnih zrnaca i njezina standardizacija

Osnova mikroflora kefimih zrnaca su bakterije mliječno-kiselog vrenja, bakterije octene kiseline i kvasci. Mikroflora je raspoređena na različitim slojevima kefirnih zrnaca. Kvasci koji ne fermentiraju laktozu nalaze se u unutrašnjim slojevima kefimih zrnaca, dok se kvasci koji fermentiraju laktozu nalaze na vanjskim slojevima zrnaca. Mezofilni streptokoki, mezofilni laktobacili i termofilni laktobacili, te bakterije octene kiseline čine površinsku mikrofloru zrnaca (Koroleva, 1988).

Prema podacima Nefedjeve i Sedove (1975), mikroflora kefira inhibira koliformne bakterije, a šigele i salmonele ne rastu u prisutnosti kefirne mikroflore.

Mikrobna kultura, koja se razvila fermentacijom kefirnih zrnaca u mlijeku, sastoji de od više različitih grupa mikroorganizama (K o r o 1 e v a, 1988):

– mezofilni homofermentativni streptokoki mliječno-kiselog vrenja (S. lactis, S. lactis subsp. cremoris). U prvim satima fermentacije ove bakterije brzo razvijaju kiselost, koja kasnije inhibira njihov daljni rast. Iz kefirnih zrnaca R os si (1978) je izolirao veće količine vrste S. durans;
– aktobacili. U kefirnim zrncima prisutno je nekoliko vrsta laktobacila, od kojih mezofilne vrste nemaju osobitu važnost za kvalitetu proizvoda. Od striktno heterofermentativnih vrsta najčešći je L. brevis, a od fakultativno heterofermentativnih L. casei subsp. rhamnosus i zatim striktno homofennentativne L. delbrueckii subsp. bulgaricus i L. helveticus. La Riviere (1963) je uočio da je oko 25% suhe tvari kefimih zrnaca izgrađeno od ekstracelularnog polisaharidnog materijala koji proizvodi L. brevis ili L. ke-
– mezofilni heterofermentativni streptokoki mliječno-kiselog vrenja (Leuconostoc mesenteroides i Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum). Te bakterije sudjeluju u tvorbi specifičnog okusa proizvoda, ali ako se razvijaju intenzivno mogu biti i uzrokom neželjenib pojava (plin) (B a v i n a, 1971);
– kvasci (Kluyveromyces marxianus subsp. marxianus, Tondaspora delbrueckii, S. cerevisiae, Candida kefir). Kvasci imaju važnu ulogu u simbiotičkim odnosima međ,u mikroorganizmima u kefirnim zrncima, zatim proizvode CO2, te daju proizvodu karakterističan okus i miris;
– bakterije octeno kiselog vrenja (Acetobacter aceti i A. rasens). Te bakterije imaju važan utjecaj na simbiotičke odnose kod mikroflore kefimih zrnaca, te poboljšavaju konzistenciju kefira povećanjem viskoziteta (B av i n a i Rozhkova, 1973).

Slika 10. Elektronska mikrofotografija kefirnog zrnca

Izostavljeno iz prikaza

Vrlo je teško održavati kulturu za proizvodnju kefira optimalnog i konstantnog saštava zbog njenog kompleksnog sastava. Evidentno je da čak i mala promjena u propišu za održavanje startera uzrokuje promjene u mikrobiološkom saštavu kefirnih zrnaca, a time i promjenu kvalitete proizvoda. Proučavajući mikrofloru kefimih zrnaca i način njihova uzgoja, mnogi autori su uočili da je kod uzgajanja različitih uzoraka zrnaca kefira pri jednakim uzgojnim uvjetima mikroflora neobično šlična. To dokazuje jedinstvenu ošobinu kefirnih zrnaca o šamoregulaciji saštava mikroflore (K o r o 1 e v a, 1988).

Kad se u mlijeko doda velika količina kefimih zrnaca (1 : 10, 1 :20) trajanje fermentacije se jako skraćuje. Međutim, količina razvijenih homofermentativnih i heterofermentativnih streptokoka te kvasaca je neznatna. Količina dodanih zrnaca u mlijeko nema značajan utjecaj na razvoj termofilnih laktobacila i bakterija octenog vrenja (Koroleva, 1988.) Najveća aktivnošt švih grupa mikroorganizama u kefimim zrncima poštiže se kod inokulacije u omjem (zrnca : mlijeko) 1 : 50. Najniži pH 3,80-3,60 kulture poštiže se pri inokulaciji u omjem 1:10, dok je pri inokulaciji 1 : 30 i 1:50 pH 4,40-4,60. Najviše hlapljivih mašnih kiselina i CO2 dobiva se kad je omjer zrnaca i mlijeka 1 : 30 do 1 : 50 (K o r o 1 e v a, 1988).

Uzgojem kefimih zrnaca pri povišenim temperaturama rast homofermentativnih bakterija mliječno-kiselog vrenja (streptokoka i laktobacila) se intenzivira. Vrijednošt pH brzo se snizuje, pa se inhibira rast homofermentativnih i heterofermentativnih bakterija mliječno-kiselog vrenja, pa je štoga i njihova količina u kefiru neznatna.

Da bi se u startem razvile sve osnovne grupe mikroorganizama, potrebno je da nakon koagulacije zrnca ostanu u kontaktu s koagulumom još 5-6 sati pri temperaturi inkubacije. Vrlo često u praksi kultura i kefima zrnca oštaju u kontaktu pri temperaturi od 7-10 °C kroz 24 sata. Međutim, ako se kultura čuva kroz šuviše dugi period, moguće je da se na površini kulture razvije Geotrichum candidum, što navršava okus i kvalitetu.

Slika 11. prikazuje utjecaj temperature na razvoj različitih grupa mikroorganizama u kulturi za kefir.

Izostavljeno iz prikaza

Miješanjem startera u toku kultivacije kefirnih zrnaca (oko 10 puta) postiže se bolji razvoj homofermentativnih streptokoka mliječne kiseline i kvasaca. Takvo povremeno miješanje ne utječe na rast heterofermentativnih streptokoka mliječne kiseline, termofilnih laktobacila i bakterija octene kiseline.

a) mezofilni streptokoki mlječne kiseline-homofermentativni
b) termofilni laktobacili
c ) streptokoki mlječne kisefme-heterofermentativni
d) kvasci
e) bakterije octene kiseline
f) kvasci tipa Mycoderma

Slika 11. Utjecaj temperature na razvoj glavnih grupa mikroorganizama u starteru za kefir (K o r oleva, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Međutim, miješanje pogoduje razvoju plijesni na površini startera i bolju raspodjelu proizvedenih metabolita u mlijeku. Slika 12. prikazuje utjecaj miješanja na razvoj mikroorganizama u kefimoj kulturi.

Pranje kefimih zrnaca (jednom u tjednu) tekućom vodom uzrokuje slabiji rast glavnih grupa mikroorganizama u kefimim zrncima. Smanjuje se aktivnost kulture, produžuje trajanje fermentacije, dobiva manje svojštven okus i iošija konzistencija gruša. Nakon pranja normalni saštav mikroflore zrnaca poštiže se nakon 3-5 dana kultivacije zrnaca. Od mikroorganizama u sastavu kefimih zrnaca jedino se aktivitet kvašaca ne umanjuje nakon pranja, čak je zapažen i bolji rast. Slika 13 prikazuje utjecaj pranja zrnaca na razvoj mikroflore kefimih zrnaca.

broj mikroorganizama 103 /ml

a) mezofilni streptokoki mlječne kiseline − homofermentativn
b) termofilni laktobacili
c) streptokoki mlječne kiseline − heterofermentativni
d) kvasci
e) bakterije octene kiseline

Slika 12. Utjecaj miješanja tijekom 24 sata inkubacije na razvoj glavnih grupa mikroorganizama i starteru za kefir (Koroleva, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

broj mikroorganizama 103 /ml
mezofilni streptokoki mljecne kiseline-hetero
termofilni laktobacili
streptokoki mlječne kiseline − hetero
kvasci
bakterije octene kiseline
broj pranja

Slika 13. Utjecaj pranja keflrnih zrnaca na razvoj glavnih grupa mikroorganizama u kulturi z: keflr (K or o 1 e v a, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Da bi starter za proizvodnju kefira bio ocijenjen kao kvalitetan, mora mati slijedeći mikrobiološki sastav (K o r o 1 e v a, 1988):

– mezofilni homofermentativni štreptokoki mliječne kiseline: 108-109/ml
– termofilni laktobacili: 105/ml
– heterofermentativni štreptokoki mliječno-kiselog vrenja: 107-108/ml
– kvasci: 105-106/ml
– bakterije octene kiseline: 105-106/ml
– kiselost: 42-44 °SH

Za poštizavanje navedenog mikrobnog sastava kulture za kefir K o r o l e a i Bavina (1970), te Koroleva i sur. (1978) propisali su sliedeće:

– mlijeko za uzgoj kulture (tj. precjepljivanje startera) treba svakodnevno obnavljati u išto vrijeme;
– :mjer zrnaca i mlijeka treba biti u od 1 : 30 do 1 : 50;
– :brano mlijeko za uzgoj kefirnih zrnaca treba pasterizirati pri 95 °C kroz 10—15 min; i
– potrebno je 2 do 3 puta miješati kulturu u toku inkubacije.

Ako se kefima zrnca održavaju (u mljekarskim pogonima) na propisani način i pažljivo, ona zadržavaju svoju aktivnost i svojstva kroz više godina. Zbog distribucije kefimih zrnaca do udaljenih potrošača, zrnca se liofiliziraju, a nakon višekratnog precjepljivanja u pasterizirano mlijeko starter kultura ima ogovarajuća svojstva i aktivnost (K o r o l e v a, 1988).

Kefir koji se proizvodi primjenom startera pripremljenog nacjepljivanjem mlijeka kefimim zrncima (»Starter 1« − Koroleva, 1988) ima karakterističnu aromu kefimih zrnaca, pa se štoga u induštrijškoj proizvodnji i preporuča isključivo primjena »startera 1« (tab. 21). Međutim, vrlo češto se za proizvodnju kefira upotrebljava proizvodni starter pripremljen fermentacijom pasteriziranog mlijeka kefimim zrncima (B a v i n a i R o z h k o v a, 1973).

Taj način upotrebljava se zbog toga što je za odvajanje kefimih zrnaca iz proizvodnog startera (»starter 1«) potrebna dodatna oprema. Za proizvodnju startera primjenom fermentiranog pašteriziranog mlijeka (fermentiranog kefirnim zrncima) Bavina i Rozhkova (1973) prepomčuju slijedeći poštupak:

– mkubaciju provoditi u posudi s mješalicom,
– mlijeko u posudi pasterizirati uz neprekidno miješanje 30 min pri 95 °C,
– mlijeko hladiti do 18 °C (ljeti) ili 22 °C (zimi),
– cijepiti mlijeko sa 2-3% startera i pažljivo promiješati,
– mkubacija (pri normalnim uvjetima) 10-12 sati,
– proizvedeni starter hladiti do 8 °C,
– kiselost startera 36-40 °SH (B a v i n a, 1977).

Slika 14 prikazuje proizvodnju kulture za kefir i njenu primjenu u proizvodnji.

Izostavljeno iz prikaza

Da bi starter za proizvodnju kefira bio ocijenjen kao kvalitetan, mora imati slijedeći mikrobioloski sastav (K o r o 1 e v a, 1988):

– mezofilni homofermentativni streptokoki mliječne kiseline: 108-109/ml
– termofilni laktobacili: 10V ml
– heterofermentativni streptokoki mliječno-kiselog vrenja: 107-108/ml
– kvasci: 105-106/ml
– bakterije octene kiseline: 105-106/ml
– kiselošt: 42-44 °SH

Za postizavanje navedenog mikrobnog sastava kulture za kefir K o r o 1 eva i Bavina (1970), te Koroleva i sur. (1978) propisali su slijedeće:

– mlijeko za uzgoj kulture (tj. precjepljivanje startera) treba svakodnevno obnavljati u isto vrijeme;
– omjer zrnaca i mlijeka treba biti u od 1 : 30 do 1 : 50;
– obrano mlijeko za uzgoj kefirnih zrnaca treba pasterizirati pri 95 °C kroz 10-15 min; i
– potrebno je 2 do 3 puta miješati kulturu u toku inkubacije.

Ako se kefirna zrnca održavaju (u mljekarskim pogonima) na propisani način i pažljivo, ona zadržavaju svoju aktivnost i svojstva kroz više godina. Zbog distribucije kefimih zrnaca do udaljenih potrošača, zrnca se liofiliziraju, a nakon višekratnog precjepljivanja u pasterizirano mlijeko starter kultura ima odgovarajuća svojstva i aktivnost (K o r o l e v a, 1988).

Kefir koji se proizvodi primjenom startera pripremljenog nacjepljivanjem mlijeka kefimim zrncima (»Starter 1« − Koroleva, 1988) ima karakterištičnu aromu kefimih zrnaca, pa se stoga u industrijskoj proizvodnji i preporuča isključivo primjena »startera 1« (tab. 21). Međutim, vrlo često se za proizvodnju kefira upotrebljava proizvodni starter pripremljen fermentacijom pašteriziranog mlijeka kefimim zrncima (Bavina i Rozhkova, 1973). Taj način upotrebljava se zbog toga što je za odvajanje kefirnih zrnaca iz proizvodnog startera (»starter 1«) potrebna dodatna oprema. Za proizvodnju startera primjenom fermentiranog pašteriziranog mlijeka (fermentiranog kefirnim zrncima) Bavina i Rozhkova (1973) preporučuju slijedeći poštupak:

– inkubaciju provoditi u posudi s mješalicom,
– mlijeko u posudi pasterizirati uz neprekidno miješanje 30 min pri 95 °C,
– mlijeko hladiti do 18 °C (Ijeti) ili 22 °C (zimi),
– cijepiti mlijeko sa 2-3% startera i pažljivo promiješati,
– inkubacija (pri normalnim uvjetima) 10-12 sati,
– proizvedeni starter hladiti do 8 °C,
– kiselost startera 36—40 °SH (B a v i n a, 1977).

Slika 14 prikazuje proizvodnju kulture za kefir i njenu primjenu u proizvodnji.

Izostavljeno iz prikaza

pasterizirano mlijeko
↓
kefirna zrnca 1;30 do1:50
↓
kefirna zrnca

pasterizirano mlijeko
↓
starter 2 do 3%
↓
pasterizirano mlijeko
↓
inkubacija 18 do 20°C 18 h
↓
hlađenje 8 do 10 °C
↓
zrenje 24 h
↓
starter II 3 do 5%
↓
proizvodnja

pasterizirano mlijeko
↓
separacija
↓
inkubacija 18 do 20 °C, 18h
↓
hlađenje 8 do 10 °C
↓
zrenje 24 h
↓
starter I 1 do 3%
↓
proizvodnja

Slika 14. Proizvodnja startera za proizvodnju kefira

Izostavljeno iz prikaza

1.4.2. Kulture za proizvodnju kumisa

Kumis je fermentirani mliječni napitak dobiven fermentacijom kobiljeg mlijeka. Od davnine se proizvodi i ima medicinsku primjenu.

Od uvođenja procesa pasterizacije u tehnološki postupak za kumis, kultura za proizvodnju kumisa sastavlja se od čistih kultura laktobacila (kao npr. L. delbrueckii subsp. bulgaricus) i kvasaca.

Prema istraživanjima Khrisanfove (1961), mikroflora kumisa sadrži tri tipa kvasaca: one koji fermentiraju laktozu (Saccharomyces lactis), one koji ne fermentiraju laktozu (S. cartilaginosus) i one koji ne fermentiraju ugljikohidrate (Mycoderma).

Najveći proizvođač (od tih kvasaca) etilnog alkohola u kumisu (2-3,5%) je, prema istom autoru, S. lactis. S. lactis i S. cartilaginosus imaju sposobnost proizvodnje antibiogene tvari, dok mliječnu kiselinu proizvode termofilni laktobacili. U starteru za proizvodnju kumisa nađeni šu i mefozilni laktobacili (kao L. kefir), ali oni bolje rastu pri višim temperaturama od onih koje su uobičajene u proizvodnji kumiša. Pošebno su važna istraživanja S k o r o d um o v e (1951) koja je utvrdila da L. lactis pokazuje veliku antibiotičku aktivnošt prema Mycobacterium tuberculosis i prema nekim drugim nepoželjnim mikroorganizmima. Veću antibiotičku aktivnost pokazuje kad raste u zajednici s bakterijama mliječno-kiselog vrenja, kako je to slučaj u kumisu.

Bannikova i Lapshina (1970) šaštavile su kulturu za proizvodnju kumisa od kravljeg mlijeka. Starter sadržava kvasac S. lactis koji je antibiotički aktivan prema Mycobacterium tuberculosis i fermentira laktozu, podvrstu L. delbrueckii subsp. bulgaricus i vrstu L. acidophilus.

Kulture za proizvodnju kumisa od kravljeg mlijeka pripremaju se u mljekarskim pogonima u uvjetima koji osiguravaju optimalni rast svih prisutnih mikroorganizama. Kultura se priprema miješanjem 10-15 ml čistih kultura L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus i kvasaca. Kvasci se pripremaju tako da se 2-3 epruvete (u kojima se kvasci uzgajaju na čvrstoj podlozi) isperu s oko 300 ml mlijeka temperature 30 °C. Mlijeko se zatim inkubira pri 30 °C 7-10 sati, a zatim pri sobnoj temperaturi daljnjih 3-6 sati zbog stimuliranja rasta kvasaca. Ovako pripremljenom kulturom nacijepi se mlijeko (10-20% cjepiva) i inkubira pri 30 °C kroz 3-8 sati, a zatim pri sobnoj temperaturi 3-6 sati. Ovako pripremljeni starter upotrebljava se za proizvodnju radne kulture za proizvodnju kumisa, cijepljenjem obranog mlijeka s 10-20% startera. Mlijeko za proizvodnju radne kulture toplinski se obrađuje pri 85-90 °C. Nakon što cijepljeno mlijeko postigne 34-36 °SH, kultura se promiješa, što poboljšava rast kvasaca. U toku 3-4 sata kultura se s vremena na vrijeme miješa (u toku 3-4 sata 10 puta po 5 minuta). Kiselost gotove kulture je između 45 i 55 ° SH (Koroleva, 1988).

1.4.3. Metabolizam mikroflore kefira i kumisa

Budući da je mikroflora startera za proizvodnju kefira i kumisa kompleksna, to su i metabolitički putevi razgradnje brojni. Laktoza se može razgraditi homofermentativnim bakterijama mliječne kiseline preko glikolitičkog i tagatoza ciklusa (Koroleva, 1988) i preko heterofermentativnih bakterija mliječne kiseline u fosfoketolaznom i Leloirovu ciklusu (Koroleva, 1988). Laktozu mogu razgraditi i kvasci preko alkoholne fermentacije. Krajnji produkti alkoholne fermentacije veoma su važni i utječu na stvaranje svojstvene arome i mirisa kefira. Ostali mikroorganizmi koji se nalaze u sastavu startera kefira i kumisa mogu povoljno djelovati na kakvoću finalnog proizvoda. Tako Saccharomyces spp. mogu fermentirati galaktozu, dok Acetobacter spp. proizvode polisaharide i dr.

Prema podacima G o r n e r a (1972) najvažniji hlapljivi sastojci koji utječu na aromu kefira su: acetaldehid, propionaldehid, aceton, etanol, 2-butanon, n-propanol, diacetil i amilalkohol. Istraživanja proteolitične i lipolitične aktivnosti startera za proizvodnju kefira i kumisa pokazala su da proteolizu uglavnom uzrokuju kvasci i bakterije octenog vrenja u prisutnosti bakterija mliječno-kiselog vrenja. U prvim satima fermentacije mikroorganizmi iz saštava startera intenzivno troše šlobodne aminokiseline, a u kasnijim šatima fermentacije utvrđeno je nakupljanje šlobodnih aminokiselina u supstratu. M e r i 1 ainen (1984) je utvrdio da se u supstratu nakupljaju prolin, leucin, tirozin, omitinska kiselina, hištidin, lizin i arginin u toku skladištenja pri niskim temperaturama.

Kulture za kefir i kumiš također sintetiziraju i tiamin, riboflavin i vitamin Bp preko aktivnosti kvasaca, a riboflavin i nikotinsku kiselinu djelovanjem bakterija octene i mliječne kiseline (K o r o 1 e v a, 1967).

Osprenova i Popova (1981) te Stojanowa i sur. (1982) utvrdili su antimikrobnu aktivnost kefira i kumisa prema vrstama Staphylococcus, Bacillus i Mycobacterium.

1.5. Kulture koje sadržavaju intestinalne bakterije

Da u sastavu »kvasa« za proizvodnju autohtonih fermentiranih mliječnih proizvoda sudjeluju i neke od fekalnih bakterija koje proizvode kiselinu ili su rezistentne na kiselinu, znanstvenicima je poznato već duže vrijeme.

Zbog korisnog djelovanja na Ijudski organizam nekih odabranih intestinalnih bakterija koje mogu rasti u mlijeku i proizvoditi kiselinu, poželjno je upotrebljavati ih u industrijskoj proizvodnji fermentiranih mliječnih napitaka, pa i u proizvodnji farmaceutskih pripravaka. Njihova upotreba u većim količinama u industrijskoj proizvodnji započela je nedavno.

Prema Kurmannu (1986), fermentirani mliječni proizvodi koji se proizvode s odabranim intestinalnim bakterijama proizvodi su budućnosti, a njihova najveća potrošnja predviđa se tijekom 2000-te godine.

Posebno mjesto i važnost u Ijudskoj prehrani od fermentiranih mliječnih proizvoda koji sadržavaju odabrane intestinalne bakterije pripada proizvodima u kojima se nalaze Lactobacillus acidophilus i bifidobakterije.

U tablici 22 navedeni su fermentirani mliječni proizvodi koji se proizvode upotrebom same bakterije L. acidophilus ili u zajednici s nekim drugim mikroorganizmima u odabranim mikrobnim kulturama.

Tablica 22. Kiselo-mliječni proizvodi pripremljeni kulturom bakterije Lactobacillus acidophilus (pojedinačno ili u zajednici s drugim mikroorganizmima) (Kurmann i Rašić, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Kiselo-mliječni proizvodi i mikroorganizmi

Acidofilno mlijeko
Acidofilna pasta
Acidofilna stepka
Acidofilna prirodna stepka
Acidofilni jogurt L. acidophilus
L. acidophilus
L. acidophilus, mezofilna kultura(a)
L. acidophilus, mezofilna kulturalal
L. acidophilus, S. thermophilus,
L. delbrueckii subsp. bulgaricus

Kiselo-mliječni proizvodi i mikroorganizmi

Biogurt
Acidofilno − kvaščevo mlijeko
Acidofilin L. acidophilus, S. thermophilus
L. acidophilus, kvašci koji fermentiraju laktozu
L. acidophilus, S. lactis, kultura za kefir

(a) 5. lactis, S. lactis subsp. cremoris, S. lactis subsp. diacetylactis, L. delbrueckii subsp. lactis

Različite vrsti fermentiranog mlijeka koje sadržavaju bifidobakterije proizvode se upotrebom čistih kultura bifidobakterija ili u zajednici s drugim bakterijama mliječnokiselog vrenja. Najčešće se ipak upotrebljavaju mješovite mikrobne kulture, jer su bifidobakterije spori proizvođači kiseline u mlijeku (tab. 23).

Tablica 23. Kiselo-mliječni proizvodi pripremljeni kulturom bifidobakterija (pojedinačno ili u zajednici s drugim bakterijama)

Kiselo-mliječni proizvod Mikroorganizmi
Bifidno mlijeko B. bifidum ili B. longum
Bifigurt B. bifidum, S. thermophilus
Biogarde B. bifidum, L. acidophilus, S. thermophilus
Biokys B. bifidum, L. acidophilus, P. acidilactici
Specijalni jogurt B. bifidum, S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus
Cultura B. bifidum, L. acidophilus
Mil-Mil B. bifidum, B. breve, L. acidophilus

Bifidno mlijeko proizvodi se u nekim evropskim zemljama (sl. 15).

standardizacija
↓
homogenizacija
↓
toplinska obrada 85 do 120 °C/5 do 30 min
↓
cijepljenje cca 10% kulture
↓
inkubacija 37 do 42 °C do grušanja
↓
hlađenje

Slika 15. Shema proizvodnje bifidnog mlijeka

Izostavljeno iz prikaza

Bifidno mlijeko je čistog, kiselo-mliječnog i slabo octenog okusa, pH 4,7 do 4,3 i sadržava 108 do 109/ml bifidobakterija.

1.5.1. Vrste kultura

Općenito, intestinalne bakterije izoliraju se od zdravih i normalno hranjenih humanih ili animalnih jedinki. Ako nisu po podrijetlu humane, bakterije koje će se upotrebljavati za humanu ishranu moraju se prethodno istražiti (metabolizam i aktivnost).

Većina mikroorganizama iz fecesa odraslih osoba su anaerobi. Od intestinalnih bakterija najčešće se za proizvodnju kiselo-mliječnih proizvoda upotrebljavaju:

Ovdje se ne spominju jogurtne bakterije L. delbrueckii subsp. bulgaricus i S. thermophilus jer one nisu prava intestinalna mikroflora čovjeka.

U tablici 24 navedena je primjena različitih vrsta intestinalnih bakterija za pripremu odabranih mikrobnih kultura i farmaceutskih pripravaka.

Tablica 24. Intestinalne bakterije koje se upotrebljavaju za pripremu kuitura (K u r m a n n, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Rod Vrsta Primjena1
Bifidobacterium B. bifidum L: Tissier (1906), djeca;
Mayer (1948), djeca
P: T 6 p fe r (1980)
D: Biogarde; Schuler-Ma-
L y o t h i sur. (1968)
B. breve L: K..K. Yakult Honska (Mada, 1982)
B. infantis L: Adachi i sur. (1983) tablete Collins i Hall (1984)
B. longum D: Lab. Wiesby (1980)
B. adolescentis L: Mutai (1980); Mada(1982)
Rod Vrsta Primjena1
Lactobacillus L. acidophilus L:Rettger i Cheplin
(1921)
D: USA (1930)
L. casei P: Alexander (1971), tablete
L. casei subsp. rhamnosus L: Schuler i S c h u 1 e r (1983)
L. kefir
(L. caucasicum) L: Brennan i sur. (1983)
S h a h an i i sur. (1985)
L. fermentum L: Bodielait (1977)
L. helveticus L: M u t a i i sur. (1978)
L. plantarum L: Bodielait (1977)
L. reuteri L: G a r v ie i sur. (1984)
L. salivarius L:Cole i Fuller (1984)
Rod Vrsta Primjena1
Streptococcus S. faecalis L: Nurmikko (1954)
S. faecium P: od 1928
S. salivarius subsp. salivaL: Marshall i sur. (1985) rius
Rod Vrsta
Prop ion ibacterium P. freudenreichii subsp. L: Acidophilno mlijeko s propion-
shermanii skim bakterijama

(Doležalek i Havlickova, 1969; Černa i Hrabova, (1982)

1 L = laboratorijski pripravak: D = industrijska proizvodnja; P = industrijski farmaceutski pripravak

Tablica 25 prikazuje sastav mješovitih starter kultura za humanu primjenu i njihovo međusobno djelovanje.

Tablica 25. Sastav mješovitih mikrobnih kultura sastavljenih od odabranih intestinalnih i bakterija mliječne kiseline (K u r m a n n, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Sastav kulture Kulturu sastavili Djelovanje i primjena
Jogurtna kultura B. longum L. acidophilus W i e s b y Lab.
Zamjena uobičajene kulture kulturom koja proizvodi sluzne tvari.
Sastav kulture Kulturu sastavili Djelovanje i primjena
S. thermophilus B. bifidum ili B. longum L. acidophilus
B i o g a r d e Comp./ W i e s b y Lab.
Simbioza S. thermophilus i L. delbrueckii subsp. bulgaricus (R a š i ć i Kurmann, 1978)
Sastav kulture Kulturu sastavili Djelovanje i primjena
Pediococcus acidolactici Bifidobacteria L. acidophilus Mljekarski institut, Prag
Inhibicija L. acidophilus s L. delbrueckii subsp. bulgaricus (Schioppa i sur., 1981)
Sastav kulture Kulturu sastavili Djelovanje i primjena
S. thermophilus L. delbrueckii subsp. bulgaricus L. acidophilus H a w l e y i sur. (1959)
Osušene kulture bakterije L. acidophilus dodane jogurtu
Sastav kulture Kulturu sastavili Djelovanje i primjena
Mliječni streptokoki ili Š. lactis ili kultura za vrhnje
Molochnikov i Trufanova (1985) Land i Lang (1978)
98% L. acidophilus i 2% S. lactis (Malkki i sur., 1970)
Sastav kulture Kulturu sastavili Djelovanje i primjena
B. bifidum B. longum Mada (1982)
Stimulacija rasta B. bifidum s B. longum (M a d a, 1982)
Sastav kulture Kulturu sastavili Djelovanje i primjena
L. acidophilus B. bifidum ili B. longum
W i e s b y Lab. Chr. Hansens lab. Stimulacija rasta
Sastav kulture Kulturu sastavili Djelovanje i primjena
S. lactis Kefirna zrnca
L. acidophilus Sharma i Gandhi (1971) Acidofilin (proizvod)
Sastav kulture Kulturu sastavili Djelovanje i primjena
S. lactis subsp. taette Geotrichum candidum L. acidophilus M e h n e r t (1960)
Sastav kulture Kulturu sastavili Djelovanje i primjena
Saccharomvces fragilis ili Candida pseudotropicalis
L. acidophilus Subramanian i S h a n k a r (1985) Smjesa acidofila i kvasca (Kovalova, 1982)
Sastav kulture Kulturu sastavili Djelovanje i primjena
B. breve i/ili B. infantis. L. casei ili L. acidophilus C h e n g i Nagasava
(1983) Stimulacija proizvodnje kiseline B. breve i B. infantis s L. caesi i L. acidophilus
Sastav kulture Kulturu sastavili Djelovanje i primjena
Saccharomyces cerevisiae L. casei M e g e e i sur. (1972) Stimulacija rasta
L. casei sa .S. cerevisiae (Megee i sur. 1972.)
(Doležalek i Havlic-kova, 1969; Černa i Hrabova, (1982)

Uzgajanje intestinalnih bakterija u mješovitim kulturama ima slijedeće prednosti (Kurmann, 1988):

– upotreba kultura sa širokim rasponom djelovanja,
– mogućnost uzgoja striktnih anaeroba u mlijeku,
– često bolji rast i bolja proizvodnja kiseline,
– općenito bolji okus,
– bolja konzistencija gotovih proizvoda.

1.5.2. Selekcija i biokemijska svojstva intestinalnih bakterija

Za industrijsku proizvodnju fermentiranih mliječnih napitaka koji sadržavaju intestinalne bakterije nepoželjne su one intestinalne bakterije koje ne hidroliziraju laktozu (lac-) i/ili ne fermentiraju produkte njene hidrolize.

Intestinalne bakterije mogu prema vrsti fermentacije proizvoditi mliječnu, octenu i propionsku kiselinu. S biotehnološke točke gledišta važno je da selekcionirana bakterija u toku procesa fermentacije proizvodi dovoljnu količinu kiseline, dok u toku skladištenja treba proizvoditi najmanju moguću količinu (Kurmann, 1988).

Poznato je da je intenzitet kiseljenja mlijeka za različite rodove, vrste i sojeve različit (izostanak, slaba ili brza koagulacija mlijeka). Moguće objašnjenje je da su intestinalne bakterije adaptirane na prirodnu sredinu, a ne na strane uvjete rasta. Hidroliza laktoze s B-galaktozidazom stimulira proizvodnju kiseline B. bifidum (Khamagaeva i sur., 1984), a enzimna hidroliza proteina mlijeka povećava proizvodnju kiseline s B. breve i B. longum (Mada, 1982). Dodatkom koncentrata rajčice, peptona i tripsina skraćuje se vrijeme fermentacije što je izvodi L. acidophilus (M i 1 e r i P u h a n, 1980).

Naknadno kiseljenje, tj. razvoj kiselosti u toku hlađenja, distribucije i skladištenja varira od soja do soja, a ovisi o:

– konačnoj pH-vrijednosti proizvoda, postignutoj nakon hlađenja,
– termoaktivnosti u toku skladištenja i distribucije (niža termoaktivnost za mnoge intestinalne bakterije nego ona za jogurt (K u r m a n n, 1983).
– genetičkim svojstvima sojeva.

Selekcionirane intestinalne bakterije daju proizvodu osebujan okus, koji se razlikuje od okusa po jogurtu. Okus je najčešće srednje kiseo, jer bakterije proizvode manje kiseline. Neznatna kiselost daje neugodan okus proizvodu. Ukoliko sojevi izlučuju alkoholnu dehidrogenazu, smanjuje se i proizvodnja diacetila i acetaldehida, jer se u pristunosti navedenog enzima acetaldehid transformira u etanol (Marshall i Cole, 1983). Neugodan okus mlijeka fermentiranog intestinalnom florom, tj. proizvod s veoma slabo izraženom aromom, vrlo često odbija potrošača. No, okus je moguće popraviti dodatkom bakterijskih kultura neintestinalnog porijekla (maslarske i jogurtne kulture i kvasci), zatim dodatkom voća, trava i dr. (N a h a i s i i R o b i n s o n, 1985) ili dodatkom kondenziranog mlijeka ili vrhnja.

Ako se u mlijeko pri pH-vrijednosti 4,65-5,14 doda treonin, neki sojevi bifidobakterija koji se upotrebljavaju za proizvodnju fermentiranih napitaka (kao B. bifidum, B. longum, B. infantis, B. adolescentis) proizvode i 27 do 39 ppm acetaldehida (Marshall i sur., 1982). L. acidophilus proizvodi acetaldehid, ali izlučuje i alkoholnu dehidrogenazu, te su fermentirani napici proizvedeni ovim mikroorganizmom neprivlačnog okusa. Dodatkom treonina u mlijeko uz dodatak sirutkinih proteina pojačava se proizvodnja acetaldehida i poboljšava okus proizvoda (Marshall i Cole, 1983). CO2 uglavnom nastaje tijekom heterofermentativnih fermentacija laktoze i propionata, te alkoholne i citronske fermentacije. Ta aktivnost bakterija može biti uzrokom nadimanja omota ambalaže, osvježavajućeg okusa, ali može utjecati i na jače izdvajanje sirutke.

Neki sojevi intestinalnih bakterija proizvode sluzne supstance, pa se u startere uvrštavaju zbog boljeg viskoziteta, odnosno konzistencije fmalnog proizvoda. Takvi sojevi mogu se uzgajati i odvojeno, i onda dodavati u proizvodnu kulturu.

Sluzotvome bifidobakterije proizvode kapsularne i nekapsulame polisaharide (Wang i sur. 1963). Oyama (1982) je uočio da B. longum proizvodi izvanstanični polisaharid koji ima antitumorska svojstva.

I neki sojevi L. acidophilus, L. brevis i L. plantarum proizvode mukopolisaharide (Aubert i sur., 1968). Neki sojevi bifidobakterija pokazuju slabu proteolitičnu aktivnost u mlijeku, ali to se svojstvo razlikuje od soja do soja. Prema Dittmannu i sur. (1965). B. bifidum može iz proteina mlijeka osloboditi aminokiseline ako se uzgaja pri 37° C kroz 60 i 90 sati.

Borisova i Slivko (1973) su izdvojili šest sojeva bifidobakterija (koaguliraju mlijeko za 18-28 sati), koji su pokazivali proteolitičnu aktivnost koja se može usporediti s proteolitičnom aktivnošću streptokoka mliječno-kiselog vrenja.

Cheng i Naga sa wa (1982) utvrdili su da B. breve subsp. breve posjeduje aminopeptidazu, ali nema ekstracelulamu kazeolitičnu aktivnost.

Machuga i Ives (1984) izvijestili su o hidrolizi peptida, a E 1 − S oda i Desmazeaud (1982) o hidrolizi B-kazeina s L. acidophilus. O značajnoj proteolitičnoj aktivnosti selekcioniranih L. acidophilus sojeva izvjestili su u svojim radovima Singhi i Sharma (1983) i Koroleva i sur. (1983).

Lipolitična aktivnost selekcioniranih intestinalnih mikrobnih kultura najčešće je vrlo slaba (El-Soda, 1968), a očituje se veoma malim promjenama u sastavu mliječne masti.

Najvažniji biotehnološki kriteriji i parametri za selekciju intestinalnih bakterija prikazani su u tablici 26. Istraživanja pojedinih sojeva obavljena su u svježe steriliziranom obranom mlijeku (10% suhe tvari, sterilizirano pri 115 °C/10 min) uz dodatak različitih količina cjepiva (1, 2, 4, 8, 16%) pri različitim temperaturama inkubacije (0, 5, 10, 30, 40 i 45 °C) i uz različito trajanje inkubacije i skladistenja (1, 7, 20 sati; 1, 2, 4, 8 dana; 1, 2, 3, 4 tjedna) (Kurmann, 1988).

Tablica 26. Biotehnološki selekcijski kriterij za istraživanje intestinalnih starter bakterija (K u rm a n n, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Selekcijski kriteriji
Intenzitet proizvodnje kiseline
Zakiseljavanje je često nedovoljno, često nepouzdano kao kriterij; moguće je pratiti rast bakterija.
Naknadno kiseljenje
Općenito, manje naknadno zakiseljavanje u usporedbi sjogurtnim kulturama.
Obratiti pažnju sojevima koji sporo proizvode kiselina i postižu slabo zakiseljavanje.
Okus i aromatične tvari
Okus mora biti tipičan za odgovarajući tip fermentacije.
Sluzavost
Nekontrolirana proizvodnja sluznih tvari u mješovitim kulturama.
Proizvodnja plina
Prejaka proizvodnja plina ima negativan utjecaj na okus, umanjuje trajnost proizvoda zbog nadimanja omota.
Parametri za selekciju
– Postizavanje minimalnog pH 4,7 ili 0,8 g kiseline/100 g u toku 7-20 sati pri optimalnoj temperaturi uz 1-5-10% cjepiva.
– Kod dodatka neintestinalnih bakterija obratiti pažnju na selekcionirane sojeve koji su srednje jaki ili slabi proizvođači kiseline
– Krajnji pH 4,20 (varira od pH 5 do 3,6)
– Termoaktivnost između 0-15” C, treba biti što je moguće niža.
– Nepovoljan dodatak bakterija mliječno-kiselog vrenja s jakom naknadnom acidifikacijom.
– Slabo kiseo okus (pH između 4,6 i 4,3) s preslabo izraženom kiselosti je nepoželjan.
– Istražiti mogućnost proizvodnje diacetila i acetaldehida te redukcije u toku proizvodnje i skladištenja.
– Mjeriti viskoznost ili konzistenciju.
– U toku skladištenja se ne umanjuje viskoznost
– Istražiti mogućnost hegativnog utjecaja na pojedine sojeve u smjesi.
– Ako je potrebno, istražiti intenzitet proizvodnje plina u određenom vremenu.
– Ako je nepovoljna, selekcionirati sojeve koji proizvode malo plina.
– Obratiti pažnju na dodatak kvasca ili na kvasce koji se nalaze u starteru, zbog proizvodnje plina.

1.5.3. Kriteriji za selekciju bakterija namijenjenih proizvodnji dijetetskih mliječnih napitaka

Selekcionirane intestinalne bakterije namijenjene proizvodnji moraju preživjeti u probavnom traktu u dovoljnom broju. Prva nepovoljnost za njihovo preživljavanje je želučana kiselina. Tablica 27 prikazuje rezultate istraživanja rezistencije nekih intestinalnih bakterija (pH rezistenciju i preživljavanje u želucu, in vivo) (skraćeno prema K u r m a n n, 1988).

Tablica 27. Rezultati pokusa preživljavanja odabranih bakterija u probavnom traktu Ijudi (skraćeno prema Kurmann, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Metode testa za rezistenciju
Mogućnost prolaza kroz želudac i probavni trakt (in vivo)
Probava in vitro (smjesa HCl, pepsina i kimozina)
pH
Sok iz humanog želuca
Uvjeti kao u želucu
Umjetni želučani sokovi (pH 3,0 inkubacija 37°C)
Istraživani mikroorganizmi
L. acidophilus NCDO 1748 preživljava (Petterson i sur., 1983)
L. acidophilus, preživljava (Kilara, 1980) Jogurt i kulture za kiselo mlijeko, preživljavaju različito dugo tijekom probave (Kilara, 1980)
P. fieudenreichii, preživljava bez gubitka vitalnosti (Mantere − Alhonen, 1983)
L. bifidum (4 soja) preživljava 2 sata pri pH, 2,4 i 6,5 (L i p i n s k a, 1978)
L. acidophilus, preživljava (Pettersson i sur., 1983)
L. acidophilus i L. plantarum preživljavaju 3 sata. L. delbrueckii subsp. bulgaricus 1 sat (Y akult, 1971).

Za primjenu bakterija u proizvodnji dijetetskih napitaka i ostalih dijetetskih proizvoda veoma je važno poznavati njihove mogućnosti proizvodnje različitih, za zdravlje važnih, i korisnih ali i nepoželjnih enzima.

Neki enzimi intenstinalnih bakterija mogu katalizirati prokancerogenu konverziju u kancerogene supstance (kao β-glukozidaze, nitroreduktaze). Pozitivan utjecaj nekih laktobacila na aktivnost navedenih enzima dokazali su Goldin i G o r b a c h (1984).

R o w l a n d i Grasso (1975) utvrdili su da laktobacili i bifidobakterije cijepaju kancerogene N-nitrozamine. Ipak, još se malo zna o navedenim svojstvima tih bakterija.

Veliki broj intestinalnih bakterija proizvodi inhibitorne tvari s bakteriostatskim i baktericidnim djelovanjem. Neki sojevi L. acidophilus proizvode bakteriocine kao: acidolin, acidofilin, laktocidin i laktacin (Kurmann, 1988). Laktocidin se može proizvesti jedino u čvrstim laboratorijskim podlogama i ne može se izolirati iz tekućih sredina u kojima mikroorganizam prirodno raste (V i n c e n t i sur., 1959).

Acidofilin se proizvodi tokom rasta L. acidophilus u mlijeku (termostabilan i acidorezistentan u kiselim sredinama, visoko aktivan prema enteropatogenim mikroorganizmima) (Vakil i Shahani, 1965).

L. brevis proizvodi laktobrevin (Krasnikov i Sudenko, 1967), a L. delbrueckii subsp. bulgaricus proizvodi bulgarikan (Reddy i Shahani, 1971).

L. casei proizvodi 3 vrsti bakteriocina (F i 1 i p o v, 1980). L. plantarum proizvodi laktolin (Kodoma, 1952), a bifidobakterije proizvode bifidin (A n a n d i sur., 1985).

Neke intestinalne bakterije proizvode i H2O2 kao L. acidophilus i L. casei (Gilliland i S p e c k, 1977; Dahiya i Speck, 1967; Kilara i Treki, 1984). Neki sojevi L. acidophilus i S. faecalis proizvode lizozim (Coyette i Shockman, 1973), a neke bifidobakterije lizozimu slične tvari (M i n i g a w a, 1970)

1.5.4. Faktori koji utječu na održavanje kultura

Laktobacili su poznati kao bakterije koje su veoma zahtjevne za svoj rast: zahtijevaju brojne aminokiseline, vitamine i druge faktore rasta u podlozi. Bifidobakterije mogu rasti u polusintetičnoj podlozi sa samo tri aminokiseline, ali uz dodatak brojnih vitamina i nukleotida, uz laktozu i neke minerale. Mnogi sojevi rastu u podlozi s amonijevim solima uz dodatak cistina (ili cisteina), biotina, pantotenata, ugljikohidrata (koje mogu fermentirati) i minerala. Neki sojevi ne iskorištavaju pantotensku kiselinu, ali troše pantetin. B. bifiidum pennsylvanicus treba za rast pantetin i saharide koji sadrže N-acetilglukozamin. Peptoni služe kao izvor pantetina, a ženino mlijeko sadrži saharide s N-glukozaminom. Sojevi bakterije B. bifidum za svoj rast zahtijevaju peptide, a najvažniji su saharidi koji sadrže N-glukozamin. Neki sojevi upotrebljavaju amonijak kao izvor dušika, dok drugi trebaju organski dušik. Može se ustvrditi da su bifidobakterije vrlo heterogena grupa bakterija po svojim nutritivnim zahtjevima (Rašić i Kurmann, 1983).

Rast tih bakterija pomažu tvari koje snižavaju redkos potencijal (askorbinska kiselina, cistein) i slijedeće tvari:

– organske tvari: ekstrakt pankreasa,
– ekstrakti biljaka: rajčice, kukuruza, crvene mrkve,
– ekstrakt i autolizat kvasca,
– ugljikohidrati: laktoza, hidrolizirana laktoza, glukoza i organske N-tvari (hidrolizati kazeina, peptidi).

Hidroliza mliječnih proteina i laktoze stimulira proizvodnju kiseline u mlijeku u nekih sojeva bifidobakterija (Kurmann, 1988). Nutritivni zahtjevi bakterija mliječno-kiselog vrenja vrlo su kompleksni. Za rast L. acidophilus, L. casei i druge iaktobacile bitne su slijedeće aminokiseline: arginin, glutaminska kiselina, izoleucin, leucin, triptofan, tirozin i valin (G o n s a 1ves i sur., 1957). L. acidophilus (soj 204) proizvodi maksimalnu količinu mliječne kiseline nakon dodatka dezoksiribozida, a L. acidophilus (soj 207) zahtijeva adenozin (H u h t a n e n i W i 11 i a m s, 1963).

Sabine i Veselekos (1967) utvrdili su da su Mn i Mg faktori rasta L. acidophilus sojeva, a Marshall (1983) da tiolne grupe favoriziraju rast L. acidophilus, što znači da će dodatak sirutkinih proteina u mlijeko potaknuti rast ovog mikroorganizma. Prema Mileru i Puhanu (1980), sok od rajčice, pepton i tripsin stimuliraju rast i proizvodnju kiseline bakterije L. acidophilus.

Sve bitne tvari potrebne za rast bakterija mliječno-kiselog vrenja sadrži mlijeko. Uzrok slabog razvoja nekih bakterija u mlijeku najčešće je u tome što neke od hranjivih tvari nisu u najpovoljnijoj formi za upotrebu.

Od intestinalnih bakterija mogu se selekcionirati samo one koje mogu rasti i razvijati se u mlijeku.

Ponekad je potrebna duža adaptacija sojeva za rast u mlijeku, pa i dodatak promotora rasta koje za potrebe mljekarske industrije proizvode neki specijalizirani laboratoriji (npr. W i e s b y Lab.).

Za bifidobakterije najčešće se upotrebljavaju autolizat i ekstrakt kvasca, koji međutim nisu uvijek i zadovoljavajući promotori rasta. Dodaju se u količini od 0,1-0,5%. Dodatak glukoze (1-5%) zajedno s kvaščevim ekstraktom može znatno skratiti vrijeme koagulacije (Evog, 1965).

Dodatak 20% pepsinom razgrađenog mlijeka poboljšava rast bifidobakterija ^zoliranih iz fecesa djece, navode Z i a j k i i sur. (1974).

Bifidobakterije mogu biti mikroaerofilne i striktno anaerobne . Svježe izolirani soj B. bifidum može biti anaeroban, a nakon više precjepljivanja i uzgoja u mlijeku može pokazati određenu toleranciju prema kisiku (H a r a b o v a, 1975).

Anaeroban uzgoj sojeva u laboratoriju nije poželjan, jer se kasnije ne postižu striktno anaerobni uvjeti rasta u mlijeku pri proizvodnji na industrijskoj liniji. Poželjno je izolirati sojeve koji mogu rasti i bez specijalnog anaerobnog uzgoja.

Kod mnogih sojeva intestinalnih bakterija potrebano je povećati postotak cjepiva (5-10%) da se osigura dovoljno brza fermentacija mlijeka.

1.5.5. Načini nabave i distribucija kultura, te pregled pripreme kultura sa selekcioniranim intestinalnim bakterijama

Tri su načina dostave kultura namijenjenih industrijskoj proizvodnji sa selekcioniranim intestinalnim bakterijama: klasične tekuće kulture koje se precjepljuju u mijekarskim laboratorijima ili smrznute koncentrirane kulture. Također, intestinalne bakterije moguće je dodavati nakon fermentacije kao prethodno koncentrirane i osušene kulture ili kao dijetetske dodatke u mlijeko nakon završene fermentacije s odabranim bakterijama mliječno-kiselog vrenja.

Načini na koje industrija nabavlja intestinalne bakterije mogu biti slijedeći:

– od laboratorija koji proizvode komercijalne kulture,
– upotreba sojeva koji su testirani u istraživačkim institutima (kao npr. B. bifidum sojevi provjereni od Tissiera − Pasteurovog instituta, Pariz; sojevi L. acidophilus što su ih izučavali Goldin i Goldbach (1984) i dr.),
– sojevi što su služili za proizvodnju ili su izolirani iz farmaceutskih pripravaka i dr.,
– sojevi koji su patentom zaštićeni.

Sve podatke o zdravstveno povoljnim karakteristikama sojeva potrebno je zatražiti od proizvođača kultura.

U tablici 28 navedeni su proizvođači pojedinačnih sojeva i mješovitih kultura intestinalnih bakterija (K u r m a n n, 1988).

Tablica 28. Proizvođači pojedinačnih sojeva i mješovitih kultura selekcioniranih intestinalnih bakterija (K u r m a n n, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Rod Vrsta
Smjesa kultura B. bifidum ili B. longum
L. acidophilus
S. thermophilus
Bifidobacteria
L. acidophilus
P. acidilactici
Bifidobacteria
L. acidophilus
Bifidobacteria B. bifidum
B. bifidum
(Tissierov soj izoliran 1900)
B. bifidum subsp.
pennsylvanicus
B. breve
B. longum
Lactobacilli L. acidophilus
L. casei
L. bulgaricus LB-51
Streptococci S. faecalis
S. faecium
Propionibacterium P. freudenreichii subsp. shermanii
Različiti rodovi Različite vrste
Rod Proizvođač
Smjesa kultura Bi, Wy (oba proizvođača koncentrirane kulture) CS
Ha (pod nazivom AB-starter, konc. kultura
Bifidobacteria Bi, Ya, Wy
Pa, ATCC, DSM
ATCC (ne raste na kravljem mlijeku) Ya Wy, Ya
Lactobacilli AB, Ha, Ma, Wy
Ha, Ma, Wy
LPAS i spec. sojevi s antitumor svojstvima
Streptococci ATCC
ATCC
Propionibacterium Ha. Ma, Wy
Različiti rodovi Kolekcija kultura kao: ATCC, DSM, PA

1 Podrijetlo sojeva mora biti provjereno.

Wy − Wiesby Lab. (SR Germany)
Bi − Biogarde (Liechtenstein)
CS − Dairy Res. Inst. (Prag)
Ha − Chr. Hansens Lab. (Danska)
AB − Aplin i Barrett Ltd. (Engleska)
Ma − Mafshall Prod., Miles Lab. Inc. (USA)
ATCC − American Type Culture Collection (USA)
DSM − German Collection of Microorganisms (SR Germany)
Pa − Collection of Pasteur Institute (Francuska)
Ya − Fermentation Research Inst. (Japan)
LPAS − Laboratory for Res. and Prod. of Biologically Active Substances (Bugafska, Sofija)

U tablici 29 naveden je pregled pripreme startera sa selekcioniranim intestinalnim bakterijama za proizvodnju mliječnih napitaka (Kurmann, 1988).

Tablica 29. Pregled načina pripreme kultura sa selekcioniranim intestinalnim bakterijama

Izostavljeno iz prikaza

Proizvodač kultura

Vlastiti i svježe izolirani sojevi (pažljiva izolacija i identifikacija)
Sojevi izolirani ili upotrijebljeni za testiranje larmaceut-skih svojstava
Proizvodač kultura
Koiekcija sojeva
Zatražiti dckiaraciju za soj
Starter kuiture proizvođača lab. kuitura

Podrijetlo sojeia

Sojevi koji se nalaze u pojedinint dijelovima probavnog trakta
Zdrave. normaino hranjene osobe
Pažljiva tehnika izio-acije i uzorkovanja

Identifikacija

Sposobnost razvoja u mlijeku nakon višekratnog precjepijivanja u ntiijeku
Rast uz 1-10% inokuluma
Dodatak tvari za sniženje redoks potenci-jala i promotora ra-sta za laboratorijsku kuituru
Tolerancija kisika
Koaguiacija mlijcka kroz 24 sata (pH 4.60)
Održavanje virulentnosti i aktivnosti u namirnicama prije konzuinacije
Acidorezistentnc (pH 4.2-4.7)
Decimalno uginuće nije kraće od, 3.5 dana.
Kolekcija sojeva Starter kuiture proizvođača lab. kultura
Zatražiti deklaraciju za soj
Podrijetlo sojeva

Tablica 30. prikazuje biotehnološko-organoleptičke parametre selekcije i održavanja intestinalnih bakterija.

Tablica 30. Biotehnološko-organoleptički kriteriji selekcijc i održavanja startera (Kurinann. 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Kriteriji za selekciju

Zakiscljavanje (slabo do sred nje jako)
Postacidifikacija
Proizvodnja aromatičnih supstanci i redukcija (diaeetil i acctaidehid)
Proizvodnja plina (izlučivanje sirutke. nadimanje omota)
Različiti okus zbog utjecaja organskih kiselina u mješovitoj kulturi
Enzimska aktivnost s obzirom na tem-peraturu. pH i vrijeme
Proizvodnja sluzi i dipolimerizacija
Razmnožavanje i održavanje kultura u mlijeku
Razmnožavanje kultura oteža-no; preporuča se primjena kon-centriranih kultura
Mogućnost dodatka liofiliziranih kultura u fermenfiranc proizvode
Fermentativna aktivnost spora. potrebno duže vrijeme za kiseljenjc
Aromatizacija proizvoda

2. Kulture za proizvodnju sireva

Na kakvoću sira utječu brojni činioci (sl. 16).

KVALITETA MLIJEKA i STARTERI
↓
PROIZVODNJA
↓
SASTOJCI + ODNOS VRUEME-TEMPERATURA + KOAGULACIJA, MEHAN. OBR.
↓
MIKROBNA POPULACIJA U SIRU
↓
FERMENTACUA — KOLICINA VODE
↓
KVAUTETA SIRA
↓
KONZISTENCIJA, OKUS, SIRNE OČICE, TRAJNOST

Slika 16. Činioci koji utječu na kakvoću sira

Izostavljeno iz prikaza

Proizvodnja sireva, između ostaloga, ovisi i o fermentaciji laktoze bakterijama mliječno-kiselog vrenja. Proizvedena mliječna kiselina daje svježi kiseo okus simog koaguluma i sudjeluje u sirišnoj koagulaciji mlijeka pri proizvodnji sira. Niska pH-vrijednost svježeg sirnog koaguluma (5,0-5,2) potiskuje razvoj patogenih i plinotvornih bakterija, što povoljno utječe na trajnost proizvoda. Bakterije mliječne kiseline proizvode i neke aromatične tvari, a njihova slaba proteolitična i lipolitična aktivnost pomažu proces zrenja sira (R o b i nson, 1983). Rast bakterija mliječno-kiselog vrenja snižava oksidoredukcijski potencijal (Eh), pri kojem se reduciraju S-spojevi (kao metantiol) koji mogu utjecati na aromu sira (Cheddar) (M a n n i n g i sur., 1976).

U prošlosti je fermentacija laktoze u mlijeku namijenjenom proizvodnji sira ovisila o prirodnoj kontaminaciji mlijeka bakterijama mliječne kiseline. U današnje vrijeme, kad se velike količine mlijeka prerađuju u sir, brza i pouzdana fermentacija veoma je važna. Bakterije koje se prirodno nalaze u mlijeku unište se u procesu pasterizacije i potrebno ih je nadomjestiti tj. treba nacijepti mlijeko za proizvodnju sira odabranim mikroorganizmima.

U sirarskoj proizvodnji upotrebljavaju se sojevi sposobni da proizvode kiselinu i aromatične tvari, kako bi se u procesu proizvodnje sirnog koaguluma proizvela dovoljna količina kiseline i na tržište stavio sir uvijek ujednačene kvalitete.

Bakterije mliječno-kiselog vrenja koje se u proizvodnji sireva upotrebljavaju kao starter-kulture su streptokoki, leukonostoci i laktobacili. Selekcionirane vršte tih bakterija upotrebljavaju se kao mješovite kulture ili pojedinačni sojevi kultura ili smjese pojedinih sojeva kultura (S h a r p e, 1979).

Mezofilne starter-kulture (optimum rasta 20-30 °C) upotrebljavaju se u proizvodnji velikog broja sireva, a termofilne starter-kulture u proizvodnji sireva kod kojih se simo zrno dogrijava (npr. Parmezan). Kultura treba preživjeti temperaturu dogrijavanja ~ 45 °C i treba rasti pri relativno visokim temperaturama.

Vrlo je važno za proizvodnju sira upotrebljavati kvalitetne kulture koje proizvode dovoljnu količinu kiseline (prema tehnološkom propisu), ne proizvode tvari gorkog okusa i osiguravaju uvjete za razvoj svojstvene arome sirnog koaguluma. Starter se razmnožava tijekom proizvodnje sira od 107 bakterija po ml do 108 − 109 bakterija u gramu simog koaguluma (Chapman i Sharpe, 1983).

Razvoj bakterija mliječno-kiselog vrenja kontrolira se soijenjem sira.

U tablici 31 prikazane su bakterije mliječno-kiselog vrenja koje se nalaze u kulturama za proizvodnju sira.

Tablica 31. Lista bakterija mlječno-kiselog vrenja koje se upotrebljavaju kao mikrobne kulture za pojedine vrsti sireva (R o b i n s o n, 1983)

Izostavljeno iz prikaza

Bakterije mliječno-kiselog vrenja Vrst sira
Mezofilne kulture
S. lactis subsp. cremoris
S. lactis ili
S. lactis subsp. cremoris
S. lactis
S. lactis subsp. diacetylactis Leuconostoc spp.
S. lactis subsp. cremoris
S. lactis subsp. diacetvlactis L. cremoris tvrdi sirevi − gouda
sirevi s plijesni − stilton
meki sirevi s plijesni
– kamamber feta
meki sir koji ne zrije
– bijeli mekani sir (sir cottage),kvark
meki sirevi koji ne zriju − bijeli mekani sir (sir cottage), kvark i krem-sirevi
Bakterije mliječno-kiselog vrenja Vrst sira
Termofilne kulture<b)
S. thermophilus i
L. helveticus
L. lactis ili
L. delbrueckii subsp. bulgaricus švicarske vrsti sireva kao − ementalac, talijanske vrsti sireva kao parmezan (grana, lodi) (tvrdi sirevi),
sirevi kao − limburški sir
Bakterije mliječno-kiselog vrenja Vrst sira
Mješovite kulture
S. lactis, S. thermophilus ili .S. faecalis i
L. delbrueckii subsp bulgaricus talijanski »pasta filata« sirevi kao − mozzarella, provolone

(a) optimalna temperatura rasta 20 do 30 C
(b) optimalna temperatura rasta 37 do 45 C

Za proizvodnju nekih vrsti sireva upotrebljavaju se plijesni. Njihova je uloga da tvore aromu, okus i miris sira, i da utječu na teksturu simog tijesta. Takve se plijesni mogu razvrstati s obzirom na njihovu boju i osobine rasta. Tako su vrste Penicillium camemberti, P. caseicolum i P. candidum bijele plijesni koje rastu na površini sira (kamamber, bri) a P. roqueforti plava plijesan koja raste unutar sirnog tijesta (rokfor, gorgonzola, plavi stilton). Ostale plijesni koje se mnogo rijeđe upotrebljavaju, tj. samo u nekim krajevima, su Mucor rasmusen (Norveška − za proizvodnju sira od obranog mlijeka s plijesnima) i Aspergillus oryzae koji se upotrebljava u Japanu za proizvodnju sira od sojinog mlijeka (Kosikowski, 1977).

2.1. Identifikacija bakterija važnih za proizvodnju sireva

Kao i fermentirani mliječni napici, i sir je posebna hranjiva podloga, visoko selektivna za neke bakterije. Vrste adaptirane na tu hranjivu podlogu kod nekih se organizama razlikuju od istih vrsta koje se uzgajaju na drugim hranjivim sredinama. Te razlike mogu biti veoma važne za praktičnu primjenu bakterija, pa je stoga važno i da »mljekarske« vrste budu identificirane. Za identifikaciju primjenjuju se modeme kemijske, enzimske i fiziološke tehnike.

Ribonukleinska kiselina (RNK) i dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) sve češće se upotrebljavaju u identifikaciji bakterija. Podaci koji se odnose na RNK dijele bakterije na veće grupe, dok podaci o DNK daju informacije na nivou vrste (Waese i Fox, 1977).

K a n d l e r (1982) je dokazao da je građa stanične stijenke veoma važna za razvoj bakterija i da može poslužiti za identifikaciju bakterija. Bakterije su organizmi s velikim brojem enzima, a to je u pogledu proizvodnje sira pa i ostalih fermentiranih proizvoda veoma važno. Povrh toga, poznavanje enzima i metabolitičkih procesa koje kataliziraju enzimi upotrebljava se za taksonomiju bakterija. Do nedavno bakterije su se uglavnom klasificirale s obzirom na sposobnost da sudjeluju u nekim kemijskim promjenama. To svojstvo, međutim, varira od roda do roda, pa je zbog toga i klasifikacija bila u većini empirijska. I potrebe bakterija za vitaminima i aminokiselinama bile su kriterij za taksonomiju, ali bilo je vrlo teško postići reproducibilnost rezultata (Rob inson, 1983). Znatno bolji rezultati u taksonomiji bakterija postignuti su upotrebom fizioloških testova. Kod primjene fizioloških testova i sasvim mala promjena genoma može biti od koristi. Za klasifikaciju bakterija prema obliku tj. prema morfološ
kim svojstvima, Fox i sur. (1980) navode da je veoma nepouzdana metoda. Važno je ovdje dodati da je taksonomija još uvijek izazov za istraživače i da svi koji žele indentificirati bakterije, općenito, ne zaokupljaju se jednostavnim problemom.

Najvažniji i prvi zadatak kulture u proizvodnji sira je po količini i brzini zadovoljavajuća razgradnja laktoze u mliječnu kiselinu. Kasnije kultura omogućuje proizvodnju diacetila, plina (CO2) i ostalih aromatičnih tvari. U početku ti se procesi odvijaju zbog rasta bakterija i djelovanja njihovih enzima. U toku zrenja i poslije soljenja mnoge bakterije ugibaju, ali se procesi nastavljaju uz posredstvo izlučenih bakterijskih enzima. Kao što se vidi iz tablice 31, za proizvodnju sira važne su bakterije mliječno-kiselog vrenja, i to mezofilne i termofilne kulture, te mješovite kulture. Identifikacija i klasifikacija važnih bakterija mliječno-kiselog vrenja prikazane su u okviru startera za fermentirane mliječne napitke, jer se za obje proizvodnje, sirarsku i proizvodnju fermentiranih mliječnih napitaka, upotrebljavaju iste vfste bakterija mliječno-kiselog vrenja.

Kad se u proizvodnji sira primjenjuju povišene temperature, u sastavu startera nalazi se najčešće S. tehermophilus (od streptokoka mliječne kiseline) i također neke vrste laktobacila. Uz te bakterije u sastavu startera, a za neke tipove sira, nalaze se i propionibakterija i brevibakterija vrste.

Bakterije propionske kiseline

Ove se bakterije najčešće nalaze u švicarskim vrstima sira (Ementaler, Groyer), tj. sirevima za koje je veoma važno da se u toku zrenja razviju sirna »oka«. Propionibakterije su anaerobne bakterije koje se mogu razvijati i aerobno u tekućim supstratima u laboratorijskim uvjetima (Garvie, 1984). Glukozu razgrađuju preko EM ciklusa, ali je utvrđeno da imaju enzime i za heksoza − monofosfatni ciklus (HMP) (Hettinger i Reinbold, 1972).

Sirevi koji zriju u prisutnosti propionibakterija razlikuju se po okusu i mirisu od sireva koji zriju samo u prisutnosti bakterija mliječno-kiselog vrenja. Proizvedeni CO2 uzrok je formiranja simih »očica«, što je karakteristično za švicarske vrste sireva.

Neke od karakteristika četiriju vrsta propionibakterija prikazane su u tablici 32.

Tablica 32. Diferencijacija Propionibacterium vrsta (Davies i Law, 1984)

Izostavljeno iz prikaza

Svojstvo Pr. freudenreichii
Sastav stanične stijenke
DAP mezo
Galaktoza +
Glukoza –
Manoza +
Ramnoza +
% G + C u DNK 65-67
Fermentacija
Laktoze ±
Trehaloze –
Manitola –
Eskulina +
Hidroliza želatine djelomično
Redukcija nitrata ±
% DNK/DNK hibridizacija<“)
Pr. freudenreichii 90
Pr. theonii 12
Pr. acidopropionici 8
Pr. jensenii 17
Svojstvo Pr. theonii
Sastav stanične stijenke
DAP L
Galaktoza +
Glukoza +
Manoza tragovi
Ramnoza –
% G + C u DNK 66-67
Fermentacija
Laktoze ±
Trehaloze +
Manitola –
Eskulina +
Hidroliza želatine djelomično
Redukcija nitrata –
% DNK/DNK hibridizacija<“)
Pr. freudenreichii 20
Pr. theonii 96
Pr. acidopropionici 35
Pr. jensenii 51
Svojstvo Pr. acidipropionici
Sastav stanične stijenke
DAP L
Galaktoza ±
Glukoza +
Manoza tragovi
Ramnoza –
% G + C u DNK 66-68
Fermentacija
Laktoze +
Trehaloze +O)
Manitola +
Eskulina +
Hidroliza želatine djelomično
Redukcija nitrata +
% DNK/DNK hibridizacija
Pr. freudenreichii 25
Pr. theonii 30
Pr. acidopropionici 87
Pr. jensenii 30
Svojstvo Pr. jensenii
Sastav stanične stijenke
DAP L
Galaktoza ±
Glukoza +
Manoza tragovi
Ramnoza –
% G + C u DNK 66-68
Fermentacija
Laktoze ±
Trehaloze +0)
Manitola +
Eskulina +
Hidroliza želatine djelomično
Redukcija nitrata –
% DNK/DNK hibridizacija<“)
Pr. freudenreichii 26
Pr. theonii 53
Pr. acidopropionici 38
Pr. jensenii 88

+ više od 90% sojeva
± između 10 i 90% sojeva
(1) slaba reakcija
manje od 10% sojeva
a) prema Johnson i Cummius (1972)
DAP − L-Lys-D-Asp tip

Slika 17. Elektronska fotomikrografija vrste Propionibaeterium freudendreichii

Izostavljeno iz prikaza

Brevibakterije

Brevibacterium linens nalazi se na površini nekih vrsti mekih sireva kao što su: Camembert, Limburger i Stilton, i vrlo je poznata u mljekarskoj industriji.

Rod Brevibacterium prema S k e r m a n i sur. (1980), čini 21 vfsta.

C r o m b a c h (1974) je istraživao Br. linens, narančasto pigmentirane organizme, izolirane iz morskih riba i nepigmentirane izolirane iz sira. U tablici 33 navedena su neka svojstva nekih sojeva i srodnih rodova bakterija.

Metabolizam brevibakterija nije se istraživao s istim intenzitetom kao metabolizam bakterija mliječne kiseline. To su češće proteolitične nego fermentativne bakterije.

Tablica 33. Svojstva brevibakterija (izoliranib iz sira) i nekih njima srodnih bakterija (skraćeno prema Daviesu i Lawu, 1984)

Izostavljeno iz prikaza

Brevibacterium linens
Šećeri u staničnoj stijenci gal
Tip DAP mezo
% G + C u DNK 52,6-64,0
Potrebe vitamina izražene
Potreba organski N u kol.
glutamin.
kiselina potrebnim za rast
Formiranje metantiola –
Morfologija štapićikoki +
Pigment narančasto
Optimalna temperatura rasta 22-30
Preživljavanje 60°/30° –
Tolerancija na NaCl (%) 10-12
Upotreba
laktoze
saharoze –
glicerola +
acetata +
laktata +
Hidroliza škroba –
Razlaganje tirozina +
Izolati iz sira 1 2 3
Šećeri u staničnoj stijenci gal gal/arb gal
Tip DAP – mezo –
% G + C u DNK 60-61, 65-67, –
Potrebe vitamina + + n
Potreba organski N n + n
glutamin.
kiselina n + n
Formiranje metantiola – – n
Morfologija štapićikoki + + +
Pigment – – –
Optimalna temperatura rasta 30, 22-30, 30-37
Preživljavanje 60°/30° – – +
Tolerancija na NaCl (%) 5-10, 5-12, 12-15
Upotreba
laktoze — ±
saharoze + – +
glicerola + + n
acetata + + n
laktata + + +
Hidroliza škroba + – –
Razlaganje tirozina n n +
Arthrobacter
Šećeri u staničnoj stijenci gal
Tip DAP mezo
% G + C u DNK 63-72
Potrebe vitamina samo
Potreba organski N biotin
glutamin.
kiselina —
Formiranje metantiola –
Morfologija štapićikoki +
Pigment –
Optimalna temperatura rasta 22-30
Preživljavanje 60°/30° –
Tolerancija na NaCl (%) n
Upotreba
laktoze
saharoze +
glicerola +
acetata +
laktata ±
Hidroliza škroba ±
Razlaganje tirozina n
Prave korinebakterije
Šećeri u staničnoj stijenci gal/arb
Tip DAP mezo
% G + C u DNK 57-60
Potrebe vitamina kompleksni
Potreba organski N kompleksni
glutamin.
kiselina kompleksni
Formiranje metantiola –
Morfologija štapićikoki +
Pigment
Optimalna temperatura rasta 30-37
Preživljavanje 60°/30° –
Tolerancija na NaCl (%) 10-15
Upotreba
laktoze n
saharoze n
glicerola n
acetata n
laktata n
Hidroliza škroba n
Razlaganje tirozina ±

+ više od 90% sojeva
manje od 10% sojeva
± između 10 do 90% sojeva n nepoznato

2.2. Kulture i njihov utjecaj na mikroorganizme kontaminante u siru

U proizvodnji sireva kulture imaju veoma važnu ulogu inhibitora rasta mikroorganizama kontaminanata. Antimikrobne tvari što ih proizvode bakterije mliječno-kiselog vrenja mogu se podijeliti u tri grupe:

– nespecifične tvari;
– specifične tvari; i
– toksične derivate kisika.

Antimikrobne tvari bakterija mliječno-kiselog vrenja i njihovo djelovanje na bakterije prikazani su u tablici 34.

Svi starteri pokazuju nespecifično djelovanje na mikroorganizme kontaminanate.

Specifične inhibitore proizvodi veći broj bakterija mliječne kiseline.

Tablica 34. Antimikrobne tvari bakterija mliječno-kiselog vrenja (Gudkov, 1986)

Izostavljeno iz prikaza

Inhibitorne tvari

Djeluje na bakterije u siru

1. Nespeciflčne tvari

1.1. Organske kiseline i pH
1.2. Apsorpcija O2, Eh redukcija
1.3. Natjecanje za laktozu
– većina mikroorganizama kontaminanata aerobni i fakultativni anaerobi saharolitični mikroorganizmi

2. Speciflčne tvari

2.1. Bakteriocini
2.2. Nisin streptokoki i laktobacili iz mlijeka enterobakterije stafilokoki klostridije, psihrotrofi i dr.

3. H2O2 i ostali derivati O2
klostridiji, stafilokoki, mikrokoki, psihrotrofi itd.

Nespecifičnu inhibiciju najčešće uzrokuje prisutnost mliječne i octene kiseline te sniženje pH-vrijednosti sira. Mnoge patogene bakterije i sporogene mogu rasti pri pH-vrijednosti koju najčešće ima i sir (pH 5,0-5,5). Organske kiseline imaju izrazitiji inhibitorni učinak od neorganskih kiselina pri istoj pH vrijednosti (Amster i Jost, 1980; Daly i sur., 1971; Rubin i sur., 1982).

Tako mliječna kiselina inhibira rast Escherichiae coli pri pH 5,1 jednako kao HCl pri 4,5 pH. R ubin i sur. (1982) su dokazali da mliječna kiselina, koja ulazi u stanicu Salmonella typhimurium u nedisociranom stanju, ireverzibilno mijenja intracelularne uvjete u stanici, što uzrokuje uginuće stanice. Starteri za sir svojim razvojem brzo troše O2 otopljen u mlijeku, a zbog toga se reducira vrijednost Eh sira (Perfilev i sur., 1982), što zaustavlja rast striktnih aeroba i jako inhibira rast fakultativnih anaeroba u siru. S t a d h ouders i sur. (1978) su utvrdili da su anaerobni uvjeti pri pH 5,2, što je uobičajeno pri zrenju sira, dovoljni da sasvim zaustave rast Staphilococcus aureus. Laktoza je sastojak sira koji starteri brzo troše za svoj rast, pa je zbog toga u siru ima u organičenoj količini. I ta ograničena količina laktoze također je jedan od faktora koji zaustavljaju rast stafilokoka i enterobakterija, tokom zrenja sira.

Utjecaj pH-vrijednosti na rast vrsta Staphilococcus aureus i E. coli u ruskom siru (Rossiiskii prikazan je u tablici 35).

Pasterizacija mlijeka, dobri higijenski uvjeti u proizvodnji i visoka aktivnost startera osiguravaju higijenski ispravan sir s obzirom na patogene i sporogene bakterije. Međutim, nije uvijek dovoljno ispuniti navedene uvjete u proizvodnji sira da bi se izbjegle pogreške čiji uzrok su klostridiji koji fermentiraju laktate (većinom Clostridium tyrobutyricum). Clostridium tyrobutyricum se razvija u podlogama koje sadrže laktate pri pH > 5,0, ali samo pri pH > 5,2 proizvodi maslačnu kiseljnu i H2 (Gudkov i Perfilev, 1980), što se očituje kao mana sira. Štete koje u siru pri pH <5,2 uzrokuju klostridiji, neće se pojaviti ako starter proizvodi dovoljnu količinu kiseline i u pravo vrijeme. Tvrdi sirevi i većina polutvrdih sireva s višim pH-vrijednostima osjetljivi su na rast klostridija. Moguće je, da bi se zaustavio rast navedenih bakterija, sniziti pH ispod 5,2, ali u tom slučaju sir gubi svoju specifičnost i kvalitetu.

Tablica 35. Utjecaj pH vrijednosti na rast Staphilococcus aureus i E. coli u siru »Rossiiskii« (Gudkov i Perfilev, 1979) i Danskom siru (S u k h a t s k e n e, i sur., 1984)

Izostavljeno iz prikaza

pH na kraju tlačenja Broj sireva Broj generacija (1)
min. Staphilococci u Rossiiskii siru
5,15-5,25 51 ne rastu
5,26-5,40 18 ne rastu
5,41-5,60 13 1
> 5,0 10 2-3
E. coli u Danskom siru
5,31-5,42 2
5,65-5,82 4 6-7
5,95-6,48 3 10-11
pH na kraju tlačenja Broj sireva Broj generacija (1)
srednje x Staphilococci u Rossiiskii siru
5,15-5,25 51 2-3
5,26-5,40 18 3-4
5,41-5,60 13 5-6
> 5,0 10 8-9
E. coli u Danskom siru
5,31-5,42 2 3-4
5,65-5,82 4 7
5,95-6,48 3 13
pH na kraju tlačenja Broj sireva Broj generacija (1)
max. Staphilococci u Rossiiskii siru
5,15-5,25 51 4-5
5,26-5,40 18 6
5,41-5,60 13 8
> 5,0 10 11-12
E. coli u Danskom siru
5,31-5,42 2
5,65-5,82 4 8
5,95-6,48 3 14-15

1) broj generacija je izračunan, uzimajući u obzir koncentraciju bakterijskih stanica u siru
2) normalni pH sira nakon tlačenja je za sir Rossiiskii 5,15-5,25, a za Danski sir 5,6-5,8.

Proizvođači sira nisu uvijek u mogućnosti postići zadovoljavajuću kiselost. Zbog toga se vrlo često za proizvodnju sira upotrebljavaju mikroorganizmi koji pokazuju jako inhibitorno djelovanje na klostridije.

U sastav kultura za proizvodnju sira uvrste se bakterije mliječno-kiselog vrenja, koje imaju izrazito antimikrobno djelovanje. Tablica 36. sadrži podatke o antimikrobnom djelovanju bakterija mliječno-kiselog vrenja.

Tablica 36. Specifična antimikrobna aktivnost bakterija mliječno-kiselog vrenja (Gudkov, 1986)

Izostavljeno iz prikaza

Vrsta bakterija mliječne kiseline Spektar aktivnosti
Clostridium tyrobutyricum
1 i 2
S. lactis +
S. lactis subsp. diacetylactis
S. lactis subsp. cremoris
Leuconostoc sp.
L. plantarum +
L. casei +
S. thermophilus +
L. helveticus +
L. delbrueckii subsp. bulgaricus +
L. acidophilus +
Kultura za sir
Vrsta bakterija mliječne kiseline Spektar aktivnosti
Staphilococcus aureus
3
S. lactis +
S. lactis subsp. diacetylactis +
S. lactis subsp. cremoris +
Leuconostoc sp. +
L. plantarum
L. casei +
S. thermophilus +
L. helveticus
L. delbrueckii subsp. bulgaricus +
L. acidophilus +
Kultura za sir +
Vrsta bakterija mliječne kiseline Spektar aktivnosti
Enterobacteria
4
S. lactis +
S. lactis subsp. diacetylactis +
S. lactis subsp. cremoris +
Leuconostoc sp. +
L. plantarum +
L. casei +
S. thermophilus +
L. helveticus
L. delbrueckii subsp. bulgaricus +
L. acidophilus +
Kultura za sir +
Vrsta bakterija mliječne kiseline Spektar aktivnosti
Psihrotrophi
5
S. lactis
S. lactis subsp. diacetylactis +
S. lactis subsp. cremoris
Leuconostoc sp.
L. plantarum
L. casei +
S. thermophilus +
L. helveticus
L. delbrueckii subsp. bulgaricus +
L. acidophilus +
Kultura za sir

Nisin je jedini antibiotik koji proizvode neki sojevi 5. lactis, a koji se proizvodi u komercijalne svrhe i primjenjuje u prehrambenoj industriji. U sirarskoj industriji primjenjuje se ili komercijalni nisin ili bakterijski sojevi koji ga proizvode, tj. sojevi se uvrštavaju u starter kulture. Budući da su sojevi koji proizvode nisin najčešće slabi proizvođači kiseline, nastoji se selekcionirati one sojeve proizvođače nisina, koji su također i dobri proizvođači mliječne kiseline (Lipinska, 1973; Senesi i sur., 1975).

Istovremeno kod sastavljanja sastava kultura potrebno je obratiti pažnju i na osjetljivost streptokoka na nisin. Kombinacijom nisin-rezistentnih i sojeva koji proizvode nisin u starteru postiže se prevencija kasnog nadimanja polutvrdih sireva. Rezultati istraživanja nekih autora (Klaenhammer i Sanozky, 1985; McKay i Baldwin, 1984; Steenson i Klaenh a m m e r, 1985) pokazali su da su sposobnost fermentacije laktoze, rezistentnost prema nisinu i fagima, streptokoka mliječne kiseline smješteni na istom plazmidu.

Sposobnost proizvodnje nisina i rezistencije prema nisinu može se prenijeti od S. lactis na S. lactis subsp. diacetylactis (Gonzales i Kunka, 1985), što znači da je moguće, poznavajući tehniku, proizvesti sojeve s različitim željenim svojstvima. Brojna istraživanja utvrdila su sposobnost bakterija mliječne kiseline da proizvode i druge antibiogene tvari, a ne samo nisin. Neki od sojeva laktobacila imaju specifičnu aktivnost na klostridije (B e r g ere i sur., 1978; Korhonen i sur., 1978; Kundrat, 1971; Simonetti i sur., 1982). Izoliran je i veći broj sojeva koji izrazito inhibitorno djeluju na enterobakterije.

Svježe izdvojene kulture streptokoka i laktobacila imaju jaču antimikrobnu aktivnost od laboratorijskih kultura, navode Makarova i Kozlova (1981). Također, navode iste autorice, u jednoj kulturi ima stanica koje imaju jaču antimikrobnu aktivnost i onih s nižom antimikrobnom aktivnosti. Najčešće, stanice s visokom antimikrobnom aktivnosti imaju slabiju sposobnost zakiseljavanja (Kopylova, 1979).

Većina specifičnih inhibitora proizvedenih bakterijama mliječno-kiselog vrenja aktivna je u kiseloj sredini (Branen i sur., 1975; Marth i H ussong, 1963; Reddy i Shahani, 1971). Neke bakterije mliječno-kiselog vrenja inhibiraju rast klostridija, stafilokoka, psihrotrofa pomoću H2O2 i drugih derivata O2. Maksimalna količina proizvedenog H2O2 u mlijeku koji proizvode streptokoki mliječno-kiselog vrenja, L. plantarum, L. acidophilus, L. lactis, i L. delbrueckii subsp. bulgaricus, ovisi o soju i kreće se od 0,03-0,19 mM (Perfilev i Gudkov, 1982), 0,06-2,06 mM (G u dkov i Perifilev, 1979), 0,4-1 mM (Collins i Koichiro, 1980), 0,4 mM (S c h u n z i sur., 1982) i 0,32 mM (S c h u n z i sur., 1982).

Koncentracija H,CL, potrebna za inhibiciju rasta stafilokoka i Pseudomonas vrsta, iznosi oko 6 p g/ml (~ 0,17 mM) (Dahiya i Speck, 1968) i 22 do 35 gg/ml (0,65-0,1 mM) (Price i L e e, 1970). Rast bakterija maslačnokiselog vrenja (ovisi o soju) reducira se 50% u prisutnosti 0,08 do 0,26 mMH,0, (Gudakov i Perifilev, 1979).

Laktobacili proizvode više H2O2 od streptokoka mliječne kiseline. Koncentracija H,O, u starterima koji sadrže streptokoke mliječno-kiselog vrenja postiže svoj maksimum na kraju lag faze i na početku eksponencijalne faze rasta, nakon čega se tvorba H,O, naglo umanjuje (Gilliland i Speck, 1969; Perfilev i Gudkov, 1982).

Laktobacili, ovisno o soju, akumuliraju H2O2 u uzgojnoj podlozi tijekom 3-15 dana uzgoja (Collins i Koichiro, 1980). Način djelovanja streptokoka i laktobacila na E. coli različit je. Streptokoki inhibiraju rast E. coli, dok laktobacili povećavaju broj uginulih stanica u mlijeku i siru (S o r okina i sur., 1985). Kombinacijom streptokoka i laktobacila u starteru pojačava se učinak inhibicije na E. coli i Staphylococcus aureus (B i e 1 e c k a i sur., 1982).

Starter kulture s izrazitim antagonističkim djelovanjem na enterobakterije i bakterije maslačnokiselog vrenja vrlo uspješno se primjenjuju u SSSR-u. Dobra kvaliteta sira postiže se i od mlijeka koje sadrži i do 100 stanica/ml enterobakterija ili sporogenih klostridija.

Međutim, treba dodati da efikasnost starter-bakterija u inhibiciji mikroorganizama kontaminanata u siru ovisi o pH, količini NaCl i vode te temperaturi zrenja sira (I b r a h i m, 1978; Stadhouders i sur., 1983).

2.3. Primjena kultura u proizvodnji sira

Primjena starter kultura u proizvodnji sira ima odlučujuću ulogu za kvalitetu sira, tj. proizvodnju sira sa željenim sastavom i organoleptičkim svojstvima. Osnovna uloga starter kulture je, kako je već navedeno, proizvodnja mliječne kiseline u točno određenoj količini, svojstvenoj za svaki tip sira. To svojstvo starter kulture se uzima i kao ocjena djelotvomosti kulture, a osigurava povoljne uvjete za zrenje s obzirom na pH, Eh, sadržaj minerala, zadržavanje sirila, kontrolu količine vode i sinereze koaguluma.

Starter kulture troše citrat, što je posebno važno za formiranje sirnih »oka« kod nekih sireva, dok je ispravna proteoliza u toku rasta bakterija iz sastava i kasnije, uključujući i enzime starter kultura, bitna za postizanje željenog mirisa, okusa i teksture zrelog sira. Različite su okolnosti koje mogu sprečavati djelovanje starter kultura, a Daly (1986) navodi slijedeće:

– vlastita kakvoća starter kultura: genetska svojstva, fiziološko stanje i mutacije;
– kontaminacija bakteriofagima: npr. iz mlijeka, startera, uređaja, zraka, sirutke;
– inhibitome supstance: antibiotici, dezinficijensi, prirodni inhibitori mlijeka, slobodne masne kiseline, bakteriocini;
– uvjeti proizvodnje: količina inokuluma, temperatura, količina kuhinjske soli.

Dobro vođenje procesa proizvodnje starter kultura uključuje uklanjanje navedenih utjecaja, a posebno je potrebno pozornost obratiti na prisutnost bakteriofaga. Kontaminacija fagima osobito je nepovoljna za mljekarske pogone koji dnevno prerađuju velike količine mlijeka u sir, jer su i ekonomske štete velike.

Za otklanjanje kontaminacije fagom u proizvodnim pogonima preporučuju se slijedeće metode:

1. Selekcija fag-rezistentnih sojeva − to mogu biti mješovite starter kulture (čiji sastav s obzirom na sojeve najčešće i nije poznat), koje se upotrebljavaju u Nizozemskoj (Stadhouders, 1986; Stadhouders i Leenders, 1984) ili i poznati sastavistarter kultura koji se već tradicionalno upotrebljavaju u Novom Zelandu (Lawrence i Heap, 1986) i Australiji (Hull, 1983), a počinju se sve češće upotrebljavati i u Sjedinjenim državama (Richardson i Ernstrom, 1985).
2. Nabavljanje smrznutih ili liofiliziranih koncentrata kultura zbog eliminacije nakupljanja izmijenjenih bakterijskih vrsta iz upotrebljavanog startera.
3. Otklanjanje svake mogućnosti kontaminacije fagom u tekućoj proizvodnji.

Istraživanja Stadhoudersa i sur. (1986) jasno su pokazala da fagosjetljivost starter kultura ovisi o uvjetima razmnožavanja i zatim (kao posljedica uvjeta razmnožavanja) o ravnoteži prisutnih sojeva. To se sasvim jasno može uočiti praćenjem primjene tradicionalnog mješovitog proizvodnog startera (»P«) i laboratorijskog startera (»L«) u proizvodnji sira, navode autori.

Proizvodni starter (»P«) precjepljivan je u uvjetima proizvodnje, dakle izložen mogućoj kontaminaciji fagom. Ako se starter uzgaja u podlogama bez dodatka koji inhibira rast faga, moguća je promjenljivost njegove kvalitete, ali nikada nije sasvim loš. tj. neupotrebljiv. Suprotno tome, »L« starter pretežno je fag-osjetljiv. Odlične »P« startere s obzirom na fag rezistenciju i sposobnost proizvodnje kvalitetnog sira sa željenim sastavom i okusom proizveo je NIZO institut. Starteri su duboko smrznuti i pri neutralnom pH i uz protektore od niskih temperatura pohranjeni pri -196 °C. Ako se oni u mljekarskoj industriji upotrebljavaju kao smrznuti koncentrati, mogu se kontinuirano primjenjivati za proizvodnju Goude u najmodemijim proizvodnim pogonima.

Kvaliteta proizvodnog startera osigurava se dodatkom antifagnih dodataka u mlijeko za proizvodnju radne kulture i strogim higijenskim uvjetima proizvodnje.

Niz godina u Novom Zelandu se u proizvodnji sireva upotrebljavaju fagrezistentni starteri. Za sastavljanje fag-rezistentnih startera potrebna je izolacija fag-rezistentnih sojeva, a za izolaciju takvih sojeva koristi se Heap i Lawrence (1976) test, u kojem se svaki soj (izoliran uglavnom iz miješovitih starter kultura) testira na osjetljivost prema određenim fagima (izolirani i pročišćeni izolati iz sirutke) u uvjetima proizvodnje sira. Djelovanje u mlijeku pri temperaturi procesa proizvodnje sira, proizvodnja plina, arome, bakteriocina, tolerancija na NaCl i DNK profili plazmida (za lakšu diferencijaciju sojeva) su ostala svojstva koja treba istražiti.

Kao što je već rečeno, za, po obimu proizvodnje velike sirarske pogone, veoma je važno osigurati postojanost proizvodnog startera, a ona se mjeri preko pH-vrijednosti mladog sira, koja mora iz dana u dan ostajati nepromijenjena. Navedena kvaliteta kulture osigurava se kontrolom prisutnosti faga u proizvodnoj kulturi jednostavnim testom inhibicije mlijeka. Neki od faga bolje se otkrivaju u pasteriziranom mlijeku nego steriliziranom mlijeku, čemu se mora obratiti pažnja kod izvođenja fag testa (Hull, 1985; Hull i Brooke, 1982).

Kod temeljitog održavanja higijene u proizvodnom pogonu i ostale kontrole, najčešće nema pojave kontaminacije fagom. Međutim, nije najvažnije osigurati odsutnost faga u okolini (proizvodni pogon) i mlijeku za proizvodnju sira, jer neki od faga imaju niski faktor multiplikacije pri uvjetima proizvodnje sira.

Tablica 37. Svojstva nekih poznatijih vrsti sireva (Scott, 1987)

Sir
Porijeklo
Voda (% max)
Mast u suhoj tvari (% max)
Veličina (cm)
Masa (kg)
Zrenje (mjeseci)
A. Tvrdi sirevi
26-25% vlage:
Parmezan Italija
Romano Italija
Sbrinz Švicarska
Emmentaler Švicarska
Grbyer Francuska
Cantal Francuska
Cheddar Engleska
Provalone Italija
Polutvrdi sirevi
Edamer Nizozemska
Gouda Nizozemska
B. Sirevi s površinskim zrenjem koje uzrokuju bakterije
Limburg Belgija
Miinster Francuska
Port du Salut Francuska
Bel Paese Italija
Tilsit Njemačka
Romadur Njemačka
C. Sirevi s plijesnima u unutrašnjosti tijesta
Stilton Engleska
Roquefort Francuska
Gorgonzola Italija
Blue SAD
D. Sirevi s plijesnima na površini sira
Brie Francuska
Camembert Francuska
E. Meki sirevi bez zrenja
Gervaise Francuska
Krem sir Engleska
Cottage SAD
Mozzarella Italija
Ricotta (punomasno mlijeko) Italija
F. Ostali sirevi
Bijeli salamureni sirevi
Feta Grčka
Sirutkini sirevi
Ricotta Italija
Topljeni sirevi

Ukoliko se starter kultura kontaminira nekim od sojeva iz sastava startera (inficirani soj), moguće je soj zamijeniti bakteriofag-neosjetljivim sojem. Baktenotag − nedsjetljfv soj izdvoji se precjepljivanjem soja uz dodatak sirutke (koja sadrži fag), ali je potrebno izolirani fag − neosjetljiv soj pažljivo provjeriti prije upotrebe u proizvodnji. Izolacija fag-neosjetljivih sojeva je zadatak na kojem je potrebno vrlo ozbiljno i predano raditi u budućnosti, kako bi se izolirali postojani fag − neosjetljivi sojevi.

2.4. Karakteristike nekih poznatijih vrsti sireva i sastav kultura za njihovu proizvodnju

Proces zrenja sira uzrokuje promjene kemijskih i fizikalnih svojstava sira uz razvoj karakterističnog okusa, mirisa i konzistencije. Svježi sir, tj. mladi sir žilav je i ponekad gumast. Sadržava većinom proteine, mliječnu mast i vodu u različitim udjelima, što ovisi o tipu sira, uz male količine soli, laktoze, mliječne kiseline, sirutkinih proteina i minerala. Tijekom zrenja simi koagulum se razlaže djelovanjem enzima, pa zreli sir poprima čvrstu plastičnu ili meku konzistenciju tijesta, već prema vrsti sira. Tablica 37 sadrži karakteristike nekih poznatijih varijeteta sira.

Tablica 38. Mikroorganizmi za proizvodnju nekih vrsti sireva (Marshall i Law, 1984)

Sir

Proizvodni mikroorganizmi

Parmenzan Romano Smjesa L. delbrueckii subsp. bulgaricus i S. thermophilus

Cheddar, Ementaler S. lactis, S. lactis subsp. cremoris, S. lactis subsp. diacetvlactis
Smjesa L. delbrueckii subsp. bidgaricus ili L. helveticus (ili L. lactis, L. helveticus) i Š. thermophilus i Propionibacterium shermanii

Provalone Smjesa termorezistentnih Lactobacillus vrsta i .S. thermophilus

Blue, Gorgonzola, Roquefort, Stilton, Camembert S. lactis + P. roqueforti
Streptokoki mlječno-kiselog vrenja P. camemberti (caseicolum)

Brick, Limburger Smjesa .S. thermophilus i S. lactis subsp. cremoris; smjesa S. thermophilus i L. delbrueckii subsp. bulgaricus; smjesa .S. lactis i S. thermophilus

Miinster Smjesa >S. thermophilus i Lactobacillus spp.

Gouda, Edam ,S. lactis, S. lactis subsp. cremoris, leukonostoci

Mozzarella Smjesa termorezistentnih Lactobacillus spp. i S. thermophilus

Cottage sir S. lactis ili .S. lactis subsp. cremoris; smjesa .S. lactis subsp.

Krem sir lactis i .S. lactis subsp. cremoris i .S. lactis subsp. diacetylactis (ili leukonostoci)

Mikrobne kulture koje se upotrebljavaju za proizvodnju sireva različite su i sadrže, uz bakterije, kvasce i plijesni. Tablica 38 sadrži podatke o sastavu starter kultura za neke poznatije vrsti sira.

Učinak kulture u proizvodnji nekih vrsti sireva

Tvrdi sirevi

Tvrdi sirevi su velika grupa sireva koju karakterizira:

a) mala količina vode,
b) primjena visokih temperatura dogrijavanja simog zrna,
c) zrenje sira uzrokuju enzimi porijeklom iz starter kultura i ne-starter bakterija, te sirilo.

Zrenje švicarskih vrsti sira završava fermentacijom laktata uz pomoć bakterija propionskog vrenja, uz proizvodnju CCh, koji formira sirna »oka« u siru.

Parmezan, koji pripada tvrdim sirevima, ima vrlo malo vode i masti. Karakteristična je za proizvodnju Parmezana upotreba mlijeka s niskim postotkom masti (2%) i termofilnih bakterija mliječno-kiselog vrenja, visoka temperatura dogrijavanja i dugo vrijeme soljenja, te dugo i sporo zrenje. Mlijeko za proizvodnju zagrijava se na 32-35 °C i dodaje se kultura koja sadržava bakterije .S. thermophilus i L. delbrueckii subsp. bulgaricus (proizvodi znatne količine kiseline) ili druge termorezistentne Lactobacillus vrste Dodaje se 1% kulture a nakon kraćeg trajanja fermentacije dodaje se sirilo (25 ml/100 litara) (Scott, 1987). Dobiveni koagulum se reže, a izrezani koagulum i izdvojena sirutka griju se prvo do 43 °C/15 min i zatim na 54-58 “C/15-30 min (vrijeme dogrijavanja ovisi o količini proizvedene mliječne kiseline).

Bakterije iz mlijeka, koje se ne nalaze u sastavu kulture imaju malu mogućnost razvoja samo do dogrijavanja koaguluma, kad se uništavaju toplinom, ali njihovi ekstracelulami enzimi sudjeluju u procesu proteolize i lipolize sirnog tijesta u toku zrenja. Slabu inhibiciju mikroflore sira uzrokuje sol u prva dva tjedna zrenja. Niska temperatura salamure (10 °C) nije povoljna za razvoj bakterija.

Mala količina vode, niska pH-vrijednost i dugo i sporo zrenje sira usporava mikrobiološke procese u siru i biokemijske promjene proteina, masti i ugIjikohidrata koje uzrokuju enzimi starter kultura ili bakterija iz mlijeka.

Marth (1979) je studirao razvoj broja živih bakterija u Parmezanu tijekom perioda zrenja. Rezultati rada pokazali su da broj bakterija opada u toku zrenja od 107 g- u svježem siru do 105 − 104 g-1 u siru nakon 14 mjeseci.

Ementaler

Sir je dobio ime po dolini rijeke Emmental u Švicarskoj, odakle i potječe. Ovaj se sir tradicionalno proizvodio u velikim kolutima (promjera 68-78 cm) mase 70-80 kg, ali se u današnje vrijeme proizvode sirevi manjih dimenzija.

Kulture za proizvodnju Ementalera su termofilne bakterije mliječnokiselog vrenja. Starter se najčešće sastoji od 0,03-0,10% 5. thermophilus, i do 0,20% L. helveticus, ili L. delbrueckii subsp. bulgaricus, uz dodatak propionibakterija (1,0-2,5 ml za 1000 lit. mlijeka).

Usitnjeni koagulum se dogrijava do 45°C (od 35°C) tako da se svake 2 minute temperatura povisi za 1 °C. Nakon toga slijedi dogrijavanje do 53-57 °C (1 °C svake minute). Dogrijavanjem se uništavaju bakterije koje nisu termorezistentne. Ukupno dogrijavanje traje oko 45 minuta (Chapman i Sharpe, 1983).

Bakterije koje imaju važnu ulogu u zrenju sira moraju preživjeti temperaturu dogrijavanja i nastaviti svoj razvoj tijekom procesa sirenja.

Bakterije propionske kiseline bitne su za razvoj karakterističnog okusa i formiranja simih »oka« kod ove vrste sira. Te bakterije fermentiraju mliječnu kiselinu, ugljikohidrate i polihidroksi alkohole do propionske i octene kiseline i CO2 (Robinson, 1983). Njihov rast je spor i pretežno anaeroban. Optimalno se razvijaju pri pH 6,7-7,0 (max. 8,5 i min. 4,6) i temperatiri 30 °C, ali mogu ostati žive i pri temperaturi 5 °C kroz 8 tjedana. Ne podnose visoke koncentracije soli.

Tijekom oblikovanja koaguluma broj stanica S. thermophilus raste sporo, ali se ubrzava pri temperaturama u toku dogrijavanja. Proces tlačenja i ocjeđivanja sira odvija se pri temperaturi 20°C kroz 20-24 sata. U toku ovog procesa temperatura sira opada do oko 50°C, pa se aktivira razvoj starter bakterija i povećava proizvodnja kiseline. Hlađenje sira odvija se brže na površini sira i termofilne bakterije mliječno-kiselog vrenja dobro se umnožavaju u prvih nekoliko sati tlačenja. S. thermophilus razvija se prvi i proizvodi mliječnu kiselinu. Nakon 2-3 sata dostigne broj 108g- u centru sira i 109 g->, oko 3 sata kasnije, na vanjskim dijelovima sira (Robinson, 1983). Laktobacili se počinju razvijati kasnije, L. delbrueckii subsp. bulgaricus nakon 4-6 sati, a L. helveticus nakon 6-8 sati, a postiže maksimalan broj nakon 20 sati. Broj laktobacila je približno 10 puta manji u središtu sira. Slika 18 prikazuje kretanje koncentracije laktoze, galaktoze i glukoze uz konfiguraciju laktata i porast mliječne kiseline, a sl. 19 kretanje fermentacije mliječne kiseline, laktoze i galaktoze uz porast CO2 tijekom grušanja mlijeka i zrenja ementalca.

Mliječna kiselina proizvodi se brže u vanjskim dijelovima, a mliječni šećer prodire (difundira) od središta sira prema vanjskom dijelu, gdje se i potroši. 24 sata riakon tlačenja sir sadržava više laktata u vanjskom dijelu nego u svom središtu. Takve okolnosti utječu na rast propionibakterija, tvorbu CO2 i hlapljivih masnih kiselina (M o c q u o t, 1979).

Kada se mladi sir star 7 do ,10 dana ostavi u toplim prostorijama, bakterije propionske kiseline brže rastu i najčešće dostižu 109 g- nakon 4 do 8 tjedana.

Zrenje ementalca se odlikuje sporom proteolizom i lipolizom i fermentacijom laktata djelovanjem bakterija propionske kiseline.

Polutvrdi sirevi

Polutvrdi sirevi proizvode se od neobranog ili od mlijeka s malim postotkom masti, primjenom mezofilnih streptokoka mliječno-kiselog vrenja.

Laktoza
Galaktoza
Glukoza

Slikal8. Kretanje koncentracije laktoze, galaktoze i glukoze uz konfiguraciju laktata i porast mliječne kiseline u ementalcu tijekom grušanja mlijeka i zrenja sira (Steffen i sur., 1988)

Izostavljeno iz prikaza

laktoza
galaktoza
ukupna mljećna kiselina

Slika 19. Mliječna fermentacija, razgradnja laktata i izdvajanje CO2 tijekom zrenja ementalca (Steffen i sur., 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Edamer i Gouda

Porijeklom su iz Nizozemske, a do današnjih dana njihova je proizvodnja postala visoko mehanizirana.

Standardizirano mlijeko temperature 30-31°C nacijepi se mezofilnim streptokokima mliječno-kiselog vrenja (0,5%). Broj živih bakterija u siru raste brzo u početku zrenja, a zatim sporo opada. U prvih 10 dana zrenja u siru prevladava S. lactis subsp. cremoris, a kasnije brzo nestaje. L. mesenteroides subsp. dextranicum brzo se razvija u prvom tjednu, a zatim njegov broj sporo opada. Hidroliza kazeina u siru se ubrzava ako pH-vrijednost sira za 3 dana dostigne 5,1 pH (Stadhouders, 1962).

Gouda (s nešto manjim postotkom vode) zrije nešto duže od Edamera. Nekoliko manjih sirnih »oka«, koja se ponekad pojavljuju zbog prisutnosti propionskih bakterija, ne ubrajaju se u mane Goude, ali se ubrajaju u mane Edamera (Robinson, 1983).

Sirevi s površinskim bakterijskim rastom

Ova grupa obuhvaća veći broj vrsti sireva koji zriju uglavnom na površini. Sirevi iz te grupe proizvode se od sirišnog koaguluma, a u toku zrenja proces proteolize djelovanjem starter kultura i sirila odvija se uz katakteristični razvoj sluzi na površini, koji uzrokuje Brevibacterium linens.

Ovi sirevi se proizvode od pasteriziranog mlijeka uz dodatak male količine kulture sastavljene od streptokoka mliječno-kiselog vrenja. Kultura može sadržavati samo 5. lactis subsp. lactis ili S. lactis subsp. lactis i S. thermophilus (Chapman i Sarpe, 1983).

Količina inokuluma varira od 0,1-0,2% (za Limburger) od 0,8% (za Port du Salut). U toku procesa proizvodnje sira streptokoki mliječno-kiselog vrenja razvijaju se brzo, pa se nakon 24 sata postigne pH oko 5,0, ali to nije podjedbakft VtšJj. sj.ra… Br.zjL razvoij mliječne kiseline pospješuje sušenje sira, a prespori razvoj kiselosti nedovoljno izdvajanje sirutke.

Prva 2-3 dana na površini sira porastu kvasci (Geotrichum candidum) koji dobro podnose kuhinjsku sol. Nekoliko dana kasnije, kada se snizi pHvrijednost sira, počinje rasti Brevibacterium linens koji uzrokuje razvoj sluzavosti na površini sira. Bre. linens je veoma aktivna proteolitična bakterija, a obim u kojem će se na nekom siru razvijati ovisi o vrsti sira (R o b i n s o n, 1983).

Sirevi s plijesnima u unutrašnjosti sira

Ovi sirevi se proizvode od zrelog mlijeka (ovčjeg i kravljeg), a proces zakiseljavanja koaguluma je spor i odvija se tijekom dugog perioda ocjeđivanja koaguluma.

Mezofilne kulture bakterija mliječno-kiselog vrenja proizvode određenu količinu mliječne kiseline koja je važna za postupno ocjeđivanje sira. Kulture su uglavnom sastavljene od Š. lactis subsp. lactis, S. lactis subsp. diacetylactis i Leuconostoc spp. dijelovi sira od unutrašnjosti do kore.

Slika 20. Hlapljive tvari u različitim dijelovima sira Limburger (Repas, 1988)

Izostavljeno iz prikaza

Okus i aroma plavih sireva ovisi o razvoju plave plijesni P. roqueforti. Suspenzija kulture P. roqueforti dodaje se ili u mlijeko prije dodatka sirila ili u slani koagulum. Tijekom zrenja sir se buši iglom, više puta, da bi se osigurala dovoljna količina zraka potrebnog za rast i metabolizam plijesni.

Roquefort i Gorgnozola buše se nakon 2-3 tjedna, a Stilton nakon 5-6 tjedana. Pri temperaturi od 10-13°C i pri 96% relativne vlažnosti zraka P. roqueforti se razvija nakon 8-10 dana, a maksimum rasta postigne nakon 30-90 dana. Maksimalni rast plijesni zapaža se u središtu sira, gdje je početna količina kuhinjske soli niža (Chapman i Sharpe, 1983).

Sirevi s razvojem plijesni na površini sira

Najpoznatiji predstavnici ove grupe sireva su Camembert i Brie. Ovi se sirevi proizvode od kravljeg mlijeka, ali se za proizvodnju nekih varijeteta iz te grupe upotrebljava kozje ili ovčje mlijeko. Sirevi se proizvode od neobranog mlijeka uz dodatak kulture i sirila, kako bi se dobio srednje kiseli meki koagulum. Camembert.

Sir potječe iz Normadije. Tradicionalno se proizvodio od sirovog mlijeka. Kultura streptokoka mliječno-kiselog vrenja dodaje se (1,5-2,5%) zbog zrenja mlijeka, I sat prije dodatka sirila. Dobiveni koagulum ocjeđuje se u kalupima pri nižim temperaturama. Kontrolom temperature i vlažnosti prostorije regulira se ravnoteža između jačine kiseljenja i smanjenja vode u siru. Visoka temperatura prostorije za ocjeđivanje sira ubrzava kiseljenje koaguluma i sprečava pretjerano izdvajanje sirutke. Nakon 24 sata sir se soli i ostavi pri temperaturi od 18—20 °C kroz 24 sata. Ovaj postupak pomaže sušenju površine sira i osigurava rast željenih mirkoorganizama na površini. Površina sira se sprej-postupkom nacijepi kulturom P. camemberti, a nakon 24 sata sir se ostavi da zrije u zrioni.

U prvih 10-14 dana zrenja sirevi zriju pri temperaturi 11-14 °C i relativnoj vlažnosti zraka 85-90% (Robinson, 1983). U tom periodu moguć je, prva 2-3 dana, razvoj nekih kvasaca (vrste iz rodova Mycoderma i Geotrichum) na površini sira. Nakon nekoliko dana, kad površina sira postane dovoljno suha, počinje se razvijati P. camemberti. Maksimalni rast plijesan postigne nakon 10—12 dana, a kad se kiselost površine sira snizi (zbog razvoja plijesni i kvasaca) pojavljuje se i raste Brevibacterium linens (C h a p m a n i Sharpe 1983).

P − površina
U − unutrašnost

Slika 21. Promjene pH-vrijednosti na površini i unutrašnjosti Camemberta tijekom zrenja (Gripon, 1988).

Izostavljeno iz prikaza

Svježi sirevi

To su sirevi s visokim postotkom vode (55-80%). Proizvode se od vrhnja, punomasnog ili obranog mlijeka. Koagulum se proizvodi dodatkom sirila i/ili kiseline i, ako se upotrebljavaju kulture, to su mezofilni streptokoki mliječnokiselog vrenja.

Mikrobiološke promjene tijekom procesa proizvodnje svježih sireva uzrokuju streptokoki mliječne kiseline koji proizvode mliječnu kiselinu. Poželjno je brzo zakiseljavanje koaguluma. Kulture sadržavaju S. lactis i .8. lactis subsp. cremoris i aromatvorne bakterije kao što su leukonostoci. 5. lactis subsp. diacetylactis često se uvrštava u sastav startera za proizvodnju, ali ova bakterija može izazvati tzv. »jogurtni okus« sira, zbog proizvodnje većih količina acetaldehida.

»Pasta filata« sirevi

Mozzarella

Proizvodi se dodatkom starter kulture sastavljene od S. lactis i S. thermophilus, te L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Kod proizvodnje ovog sira vrlo je važan brz razvoj kiselosti, što znači da se i starter mora tako sastaviti.

Ostali sirevi

Cottage sir

Ovaj sir odlikuje se slabom kiselošću i vrlo mekim koagulumom. U proizvodnji ovog sira pasterizirano mlijeko inokulira se dodatkom kulture, a koalugacija mlijeka postiže se nakon 12-13 sati (temperatura inkubacije 21-22 °C) ili nakon 4-5 sati ako se doda 4-5% startera u mlijeko temperature 31-32°C. Mala količina sirila (0,1-0,2 ml/100 l mlijeka) dodaje se zbog čvrstoće koaguluma.

Nakon koagulacije pri 4,65-4,75 pH koagulum se izreže i dogrije (u vremenu od 1 sata) do 53-57 °C (C o 11 i n s, 1961). Odvaja se sirutka, a koagulum se ispire 3 puta svakih 20 minuta. Najprije se ispire vodom (22-24°C), zatim vodom topline 10°C i na kraju hladnom vodom (3-4°C).

Koagulum se zadrži pri 1°C 1 sat. Na koagulum se dodaje fermentirano vrhnje. Fermentirano vrhnje priprema se dodatkom kulture (S. lactis subsp. diacetylactis i L. cremoris) u pasterizirano vrhnje (Chapman i Sharpe, 1983).

Kultura za proizvodnju Cottage sira najčešće sadržava više sojeva S. lactis subsp. cremoris i jedan soj S. lactis selekcionirane za brzu proizvodnju mliječne kiseline. Starter ne smije proizvoditi gorke tvari u koagulum. Ako se u sastavu startera nalaze i S. lactis subsp. diacetylactis, postoji mogućnost proizvodnje CO2, što može biti uzrokom šupljikavosti sira (S a n d i n e i sur., 1959).

Quark

Sličan je mliječno-kiselim sirevima, ali se najčešće proizvodi od obranog mlijeka. U proizvodnom postupku upotrebljava se pasterizirano obrano mlijeko u koje se dodaje starter kultura (2%) sastavljena od 5. lactis subsp. lactis i S. lactis subsp. cremoris (proizvodi od 0,7 do 0,8% kiseline).

Svježi quark se odlikuje svojstvenim izrazito mliječno-kiselim okusom.

2.5. Razvoj arome u sirevima

Više desetljeća istraživani su mehanizmi preko kojih se kod slabo izraženog simog koaguluma, relativno po okusu, mirisu i konzistenciji razvije specifična aroma i ostale karakteristike sira. Općenito je uočeno da zrenje sira ovisi o više različitih činioca, uključujući vrijednsti za pH i vodu u koagulumu, zatim načina soljenja i količine dodane kuhinjske soli, temperature zrenja sira i svojstva sekundame mikroflore (one koja nije u sastavu startera), a koja se razvija u ili na siru (Barry i Law, 1984).

Sirevi s velikom količinom vode (50-80%) nazivaju se »soft« − meki sirevi. Neki od njih troše se svježi (kao Cottage sir, Mozzarella), dok se kod drugih na površini ili unutrašnjosti razvija plijesan ili kvasci (npr. Brie, Camembert). Polutvrdi sirevi (Barry i Law, 1984) imaju 45-50% vode. Tvrdi sirevi se proizvode pri višim temperaturama obrade sirnog zrna, koja može biti i do 40°C za sireve proizvedene mezofilnim starterima i 50 °C za sireve proizvedene termofilnim starterima. Popratna (sekundarna) mikroflora najčešće se sastoji od bakterija mliječno-kiselog vrenja koje nisu u sastavu startera, zatim od propionibakterija, kvasaca i brevibakretija.

Sastojci mlijeka u toku zrenja sira − od simog koaguluma do zrelog sira − razlažu se preko različitih metabolitičkih puteva razgradnje do sastojaka koji karakteriziraju gotov proizvod. Slika 22 prikazuje procese u kojima se stvara aroma sira.

Mlijeko
fermentacija
mliječna kiselina octena kis.
diacetyl acetaldehid etanol
peptidi aminokiseline amini S-spojevi
ketoni
laktoni aldehidi
masne kiseline
propionska kiselina
tioesteri
Sir
citrat
laktoza
proteini
lipidi

Slika 22. Glavni putevi razgradnje u kojima se oblikuje aroma sira (B a r r y i Law, 1984)

Izostavljeno iz prikaza

Sličnost i razlike između različitih tipova sira istraživao je Law (1982), a kraći sumirani pregled prikazan je u § tablici 39.

Tablica 39. Kulture za proizvodnju i sekundarna mikroflora nekih vrsti sireva (Law, 1982)

Izostavljeno iz prikaza

Vrst sira
Primjer za vrst sira
Voda (%)
Sastav kulture
Djelovanje kulture
Sekundarna mikroflora
Glavni aromatični sastojci
sirevi koji ne zriju Cottage ne > 80 S. lactis subsp. diacetylactis, Leuconostoc spp.
Proizvodnja kiseline i diacetila nema Mliječna kis., diacetil, acetaldehid
sirevi koji zriju − meki sirevi Mozzarella > 50 S. thermophilus
L. delbrueckii subsp. bulgaricus Proizvodnja kiseline nema Mliječna kiselina
Camembert Brie 48 55 S. lactis subsp. cremoris
S. lactis Proizvodnja kiseline Penicillium caseicolicum, Kvasci Masne kiseline, NH3, aromatski karbohidrati, feniletanol
Limburger 45 S. lactis
S. lactis subsp. cremoris Proizvodnja kiseline kvasci
Bravibacterium linens Aminokiseline, masne kiseline, metantiol, acetilmetil disufid
polutvrdi sirevi Gouda 40 S. lactis subsp. cremoris
S. lactis
S. lactis subsp. diacetylactis
Leuconostoc Proizvodnja kiseline i CO2 Propionibacterij e Aminokiseline, masne kiseline
plavi sirevi Roquefort Gorgonzola Stilton 40-45 S. lactis
S. lactis subsp. diacetylactis
S. lactis subsp cremoris Leuconostoc spp. Proizvodnja kiseline i CO2
Penicillium roqueforti, kvasci, mikrokoki Masne kiseline, ketoni, laktoni, aromatski karbohidrati
tvrdi sirevi Ementaler 38 S. thermophilus
L. helveticus L. lactis
L. delbrueckii subsp. bulgaricus
Propionibacterium shermanii Proizvodnja kiseline i CO2, propionske kiseline
Propionibacetirium shermanii, grupa D streptokoka
Aminokiseline (prolin), peptidi, maslačna kiselina, octena kiselina, metantiol, tioesteri, dimetil sulfid, alkalni pirazini

2.5.1. Uloga ugljikohidrata u tvorbi arome sira

Laktoza

Uloga laktoze u procesu stvaranja arome kod sireva koji ne zriju, kao npr. Cottage sir, ograničena je na nastanak izraženog kiselog okusa sira. Proizvodnja aromatičnih tvari vezana je uz metabolizam citrata. Kod sireva koji zriju fermentacija laktoze ima manje jasnu, ali zato veoma važnu ulogu u toku zrenja sira. Mlječna kiselina osigurava trajnost sira preko svojeg antibakterijskog djelovanja i snižavanja redoks potencijala i pH. Zbog tih svojstava mliječne kiseline enzimne reakcije odvijaju se sporo i većini sireva potrebno je duže vrijeme do razvoja karakterističnog okusa i arome. Nizak redoks potencijal osigurava i da S-aromatične tvari ostanu u svojoj reduciranoj formi.

Za proizvodnju Cheddar sira s čistom i ujednačenom aromom važno je u procesu proizvodnje osigurati uvjete da starter kultura utroši ukupnu količinu laktoze, tj. da ne zaostane višak laktoze za rast sekundarne mikroflore. U tu svrhu preporučuje (Turner i Thomas 1980) se pažljivo soljenje, tako da je količina soli u vodenoj fazi sira što je moguće bliže 4%. U tom slučaju kultura metabolizira laktozu u toku 24 sata u tlačenom siru. Ako je količina soli viša, starter je inhibiran te zaostaje laktoza za razvoj sekundarne mikroflore. Freyr (1982.) preporučuje brzo hlađenje tlačenog sira do 10 °C, pa sekundama mikroflora raste veoma sporo a u tim uvjetima sekundarna mikroflora razlaže laktozu homofermentativno i ne proizvode se tvari koje bi mogle utjecati na okus sira. Suprotno Cheddar siru, fermentacija laktoze do mliječne kiseline u Ementaleru i Gruyeru preko S. thermophilus i L. helveticus priprema supstrat za djelovanje sekundame flore.

S. thermophilus i L. helveticus svojim razvojem proizvode mliječnu kiselinu u kadi za sirenje, i tijekom tlačenja. Accolas i sur. (1978) i Moquot (1979) opisali su utjecaj hlađenja sira ementalca na proizvodnju kiseline, koje prvo utječe na S. thermophilus, a zatim na L. helveticus. Uočili su da se nakon 24 sata sva laktoza fermentirala u mliječnu kiselinu bliže vanjskim, hladnijim dijelovima sira. Proizvodnja CO2, produkta razvoja sekundarne mikroflore, ovisi o njenom razvoju u siru, jer regulira formiranje i veličinu sirnih »oka«. Ementaler treba imati veća sima »oka« od Gruyera, a to se postiže višom temperaturom zrenja i manjim količinama kuhinjske soli (M o q u o t, 1979).

Citrat

Citrat je, iako prisutan u maloj količini, važan sastojak mlijeka. Metaboliziraju ga S. lactis subsp. diacetylactis i leukonostoci do CO2 i C-sastojaka, uključivši i diacetil. Uloga metabolita nastalih iz razgradnje citrata u zrelim sirevima nije sasvim objašnjena: diacetil je vjerojatno važan za aromu Cheddar sira (uz ostale sastojke proizvedene u toku zrenja). Međutim, prema podacima Lavvrence i Pearce (1972), dobar Cheddar se može proizvesti i bez bakretija koje fermentiraju citrat.

2.5.2. Uloga mliječne masti u procesu stvaranja arome sira

Trigliceridi mlijeka su kvantitativno najvažniji lipidi u sim. Fosfolipidi, koji su također prisutni kao sastojci membrane masnih globula, prema L a w i sur. (1973) nemaju utjecaj na zrenje sira.

Razgradnja triglicerida ima različiti intenzitet kod različitih vrsti sireva i zato je njihov utjecaj na aromu sira različit. Tako npr. kod talijanskih sireva Parmezana ili Provalonea, aroma značajno ovisi od slobodnih masnih kiselina (Moskowitz, 1980). Također, slobodne masne kiseline su bitne za karakterističan okus i miris »plavih« sireva.

Rast plijesni u tim sirevima ograničava se dodatkom NaCl (Kinsella i Hwang, 1976). Godinho i Fox (1981) uočili su da P. roqueforti raste brže u srednjem sloju sira, jer su visoka i niska koncentracija soli (vanjski i unutrašnji dio sira) inhibitori rasta ove plijesni. Isti autori su utvrdili da je koncentracija kuhinjske soli od 1-3% (g/g) djelovala kao stimulator rasta. Spore plijesni P. roqueforti razvijaju se u ranoj fazi zrenja i micelij je vidljiv već nakon 8-10 dana. Maksimalni rast postiže se tijekom 1-3 mjeseca. Micelij i spore su jaki lipoliti, izlučuju dvije lipaze od kojih je samo kiseli enzim značajan za zrenje sira (Monassa i Lamberet, 1982). Visoka koncentracija NaCl koči lipolizu (Gadinho i F o x, 1981), ali u zoni gdje koncentracija NaCl potiče rast micelija i proces lipolize je relativno brži.

Ulogu lipolize i slobodnih masnih kiselina mnogo je teže odrediti kod sireva koji zriju bez plijesni. Sluzava površina polumekih sireva, čiji je uzrok rast kvasaca, mikrokoka i/ili B. linens, vjerojatno ima utjecaja na aromu sira, jer spomenuti mikroorganizmi imaju lipolitičnu aktivnost (S o r h a u g i Ordal, 1974).

Aroma mnogih tvrdih i polutvrdih zrelih sireva ovisi o razvoju njihove mliječno-kisele mikroflore koja vjerojatno ima i slabu lipolitičnu aktivnost (Paulsen i sur., 1980). lako niska, koncentracija hlapivih masnih kiselina u siru (5-10 g g g1 sira) ima utjecaj na organoleptička svojstva sireva. U sastav sintetskih sirarskih aroma uvijek se uvrštavaju i hlapljive masne kiseline (Stadhouders i Veringer, 1973).

Esteri masnih kiselina relativno lako nastaju u siru (M organ, 1976) ili djelovanjem mikrobnih esteraza ili kemijskim reakcijama u dugom periodu skladištenja. Uz etanol, vrlo često u siru se nalazi i etilni ester, a i drugi esteri koji se često povezuju s lošim mirisom sireva po voću. Esterifikacijom masnih kiselina kratkih lanaca s metantiolom, uz pomoć površinske miroflore sira (Cuer i sur., 1979), stvaraju se tioesteri koji sudjeluju u aromi sireva sa sluzavom površinom.

2.5.3. Uloga proteina mlijeka u tvorbi arome sira

Proteoliza

Kao i lipoliza, proteoliza u siru ima različiti intenzitet i stupanj, što ovisi o mikroflori sira. Tako npr. Cheddar (star 6 mjeseci) s relativno jednostavnom sekundamom mikroflorom ima približno 3% prisutnog ukupnog N u obliku slobodnih aminokiselina (Law i sur., 1976), dok ga zreli sir s plijesnima može imati i do 10% (Kinsella i Hwang, 1976). Uloga aminokiselina i peptida dobivenih proteolitičnim djelovanjem enzima u tvrdim i polutvrdim sirevima još nije dovoljno istražena, ali se zna da ima izravan utjecaj na aromu sira. U kojoj mjeri neki od sastojaka sudjeluje u aromi sira, nije sasvim određeno (Kirimura i sur., 1969).

Udio bakterija iz sastava kulture i sekundardne mikroflore u procesu proteolize sira znatno varira i ovisi o opsegu u kojem sekundama mikroflora ili bakterije mliječne kiseline proizvode proteinaze i peptidaze u toku zrenja sira. Mikrobna proteoliza ovisi i o djelovanju kimozina ili sredstva za koagulaciju mlijeka u sirarskoj kadi. U prvom, kratkom dijelu perioda zrenja sira kimozin nije aktivan, ali u slijedećem periodu tijekom tjedana i mjeseci zrenja taj enzim bitno sudjeluje u proteolizi sira. Smatra se da proizvodi najviše velikih peptida (1400 molekulama masa), (V i s s e r, 1977).

Endopeptidaze bakterija u kulturi sudjeluju u procesu hidrolize kazeina. Tako npr. intracelularna endopeptidaza bakterije .S. lactis subsp. diacetylactis hidrolizira as, kazein (ali ne i sirutkine proteine) i smatra se da je specifična za peptidne vezove kao X-Leu ili X-Phe (Zevaco i Desmazeaud, 1980). Kasnije su isti autori utvrdili da proteinaza hidrolizira i Pro,86 − Ile)87 i Ala189 − Phel90 u B-kazeinu, iako je njezina aktivnost u tim reakcijama slaba. Najvažnija uloga proteinaza mikrobnih kultura je razgradnja velikih peptida, razgrađenih djelovanjem sirila, u male peptide i aminokiseline. Rezultati istraživanja Millisa i Thomasa (1980) pokazali su da su, kod prfvarijanata, ekstracelularne proteinaze značajne kod proteolize sira. Međutim, većina peptidazne aktivnosti je intracelularna (Law i sur., 1974).

Intracelularne peptidaze mezofilnih kultura detaljno su studirane i opisane u mnogim radovima. Uloga termofilnih startera u proteolizi sira nije se istraživala u istoj mjeri kao uloga mezofilnih startera, ali je za te bakterije poznato da proizvode proteinaze i peptidaze (Law i Kolstad, 1983).

Proteolitična aktivnost laktobacila nešto je jača od proteolitične aktivnosti X thermophilus, iako je kod obje grupe mikroorganizama vrlo slaba (T o u rn e u r, 1972).

U usporedbi s proteolitičnom aktivnosti bakterija mliječno-kiselog vrenja, proteolitična aktivnost bijele plijesni, P. camemberti, i plave plijesni, P. roqueforti značajno više sudjeluje u proteolitičnoj razgradnji sireva (kod kojih se dodaju). Detaljno je istražena aktivnost i uloga proteinaza i peptidaza P. camemberti kod stvaranja konzistencije i oslobađanja aminokiselina kod Bria i Camemberta.

Izolirane su ekstracelulame proteinaze (kisela aspartil i neutralna metaloproteinaza) i peptidaze (karboksipeptidaze i aminopeptidaze) (L e n o i r, 1979; T r i e u − C uo t, 1982). Lenoir i Auberger (1982) utvrdili su da je kisela proteinaza najaktivnija u mladom siru od 6-tog do 16-tog dana, a da kasnije nestaje.

Neutralna proteinaza počinje svoje djelovanje od 13-tog i nastavlja do 30-tog dana zrenja sira. Optimum djelovanja peptidaza je kod Camemberta, kako navode Auberger i sur. (1982), pri relativno visokim pH-vrijednostima, pa su one aktivne u kasnijem periodu zrenja sira.

2.5.3.1. Razgradnja aminokiselina

Razgradnja (katabolizam) aminokiselina kroz djelovanje mikroflore koja se razvija na površini sira doprinosi raznolikosti arome i mirisa Camemberta. Tako npr. NH3, koji nastaje dezaminacijom aminokiselina djelovanjem kvasaca -kontaminanata (posebno Geotrichum spp.), sudjeluje u stvaranju arome sira (Hemme i sur., 1982).

Zajednička karakteristika arome sireva s površinskim zrenjem je da u aromi sudjeluju 3-metil-l-butanol, feniletanol i fenol. Poznato je da mnogi mikroorganizmi, uključivši i Bre. linens (koji se vrlo često nalazi na površini sireva) mogu leucin, fenilalanin i tirozin prevesti u 3-metil-l-butanol, feniletanol i fenol. Hlapljivi S-spojevi također znatno utječu na aromu i miris nekih sireva. P. camemberti i B. linens mogu proizvoditi H2S, dimetilsulfid i metantiol od metionina (Tsugo i Matsuoko, 1962). Također Bre. linens, u međusobnom djelovanju s mikrokokima, proizvodi različite tioestere koji bitno utječu na okus sireva sa sluzavom površinom (C u e r i sur., 1979).

Manning (1979) i Green i Manning (1982) istraživali su način nastajanja metantiola u siru i utvrdili da je veoma povezan s nastajanjem H2S. H2S mogu proizvesti laktobacili u uvjetima niskih pH-vrijednosti i ograničene količine ugljika u podlozi − siru (M a n n i n g, 1979).

2.5.3.2. Proteoliza i mane sirne arome

Osim što sudjeluju u stvaranju željene arome sira, produkti proteolize mogu biti uzrokom i loše arome sira. Tako npr. peptidi mogu biti izvor gorčine sira. Iz rezultata mnogobrojnih istraživanja koja su se odnosila na pojavu gorčine sira (N e y, 1971; Matoba i Hata, 1972; Guigoz i Solm, 1976; Champion i Stanley, 1982) vidi se da su peptidi, uzročnici gorkog okusa, sadržavali visoke koncentracije hidrofobnih aminokiselina (kao što su leucin, fenilalanin, prolin).

Prema Richardsonu i Creameru (1973) i Adda i sur. (1982) asl-kazein je glavni izvor gorkih peptida. Da li će se u siru tijekom zrenja akumulirati dovoljna količina gorkih peptida, koji će biti uzrok te mane sira, ovisi o više faktora. Tako pojava veće količine gorkih peptida ovisi o opsežnosti reakcije enzima koagulanata u simom koagulumu, zatim o broju bakterija iz startera u mladom siru, o sposobnosti startera da razgrađuje peptide i 0 brzini kojom se bakterije iz startera liziraju i izlučuju peptidaze.

Mišljenja o važnosti proteolize, koju uzrokuju mezofilne kulture, za pojavu gorčine u siru, različita su. U jednoj od najstarijih pretpostavki koju je predložio Czulak (1959) tvrdilo se da gorke peptide proizvodi kimozin, a da se primjenom tzv. »gorkih« startera ta mana može ukloniti jer primijenjeni starter razgrađuje gorke peptide. Lo wri e i Lawrence (1972) i Lowrie (1974) navode da starter bakterije također proizvode gorke peptide od kazeina. Utvrđeno je da jjri proizygdnji Cheddar sira (»brzi« starter) kgd relativno visokih temperatura dogrijavanja starter uzrokuje gorak okus sira, jer veliki broj bakterija tvori i veću količinu proteinaza. Suprotno tome »spori« starteri uzrokovali su gorčinu sira ukoliko su u procesu proizvodnje aktivirani i brzo se razvili u velikom broju.

Za pojavu gorčine kod Gouda sira Stadhouders i Hup (1975) su utvrdili da jedan od uzroka može biti i djelovanje kimozina u siru. Također, isti autori ističu da neke kulture proizvode više, a neke manje peptidaza koje razgrađuju peptide. Nije poznato da li bakterijski sojevi koji ne izlučuju gorke peptide sadrže posebne peptidaze ili sojevi izlučuju peptidaze u različitim količinama.

Chiba i Sato (1980) identificirali su aktivnost dipeptidaze i aminopeptidaze u ekstraktu stanica kultura za proizvodnju sira. Ekstrakt obaju enzima smanjio je gorčinu, ali pojedinačni enzimi nisu izolirani.

Općenito, proteoliza koju izvode mezofilne kulture za proizvodnju sira sudjeluje u pojavi gorčine sira, ali pretežno ovisi o vrsti sira, tj. proizvodnom postupku.

IV. Proizvodnja mljekarskih kultura

Kulture su, kako je već prije rečeno, pažljivo selekcionirani mikroorganizmi koji se dodaju u mlijeko zbog iniciranja i izvođenja poželjne fermantacije u proizvodnji fermentiranih mliječnih napitaka i sireva. Na taj način starter kulture utječu na karakterističan okus, konzistenciju, miris pa i boju konačnog proizvoda. Većina kultura sastavljena je od bakterija mliječno-kiselog vrenja, ali i ostale bakterije, kvasci i plijesni (u nekim sirevima) sudjeluju, uz bakterije mliječno-kiselog vrenja, u proizvodnji fermentiranih mliječnih napitaka i sireva.

Starteri mogu biti sastavljeni od jedne mikrobne vrste, više vrsta, više različitih sojeva iste vrste ili više sojeva različitih vrsta (Teuber, 1986). Ođ dobavljača kultura (specijaliziranih za proizvodnju startera) proizvođači fermentiranih mliječnih napitaka i sireva mogu nabaviti na različite načine pripremljene startere. Uvjeti industrijske proizvodnje i poznavanje startera za određenu proizvodnju najvažniji su činioci koji određuju pravilan izbor oblika startera što će se upotrebljavati odnosno nabaviti.

1. Način primjene kultura

Tri su različita oblika starter kultura za pripremu proizvodnih kultura, koje mljekare mogu nabaviti od proizvođača kultura. Slika 23 prikazuje različite načine priprema i primjene kultura u proizvodnim pogonima.

Za proizvodnju kvalitetnih fermentiranih mliječnih proizvoda vrlo je važno da starter kulture sadrže maksimalan broj živih mikroorganizama, da starteri budu visokoaktivni u uvjetima proizvodnje u mljekari i da ne sadrže kontaminante.

Za očuvanje aktivnosti starter kultura F o s t e r (1962) preporučuje:

– smanjenje i/ili kontrolu metabolitske aktivnosti mikroorganizama u sastavu startera, i
– izdvajanje mikroogranizama iz hranjive podloge u kojoj su uzgojeni.

Slika 23. Različiti načini pripreme i primjene startera za proizvodnju fermentiranih mliječnih proizvoda (M e r i l a i n e n, 1988)

uobičajene kulture
koncentrirane kulture
priprema startera kod proizvođača
aktiviranje kulture
priprema proizvodne kulture
nacjepljivanje mlijeka za proizv. ferment. proizvoda
tekuće kulture
osušena
duboko
smrznuta
kultura
2-3 precjepljiv

Startere namijenjene proizvodnji r?dnih kultura, mljekare nabavljaju od proizvođača kao:

1. tekuće kulture

2. osušene kulture:
a) spray-osušene
b) duboko smrznute − osušene (liofilizirane) ili
c) koncentrirane − duboko smrznuteosušene: i

3. smrznute kulture:
a) smrznute pri − 40 °C i
b) smrznute u tekućem dušiku pri − 196 °C.

Posljednjih godina za proizvodnju fermentiranih mliječnih proizvoda upotrebljavaju se koncentrirani starteri, a razlozi su slijedeći (G i 11 i 1 a n d, 1983):

– lako se primjenjuju,
– njihova kvaliteta je provjerena i dobro zaštićena,
– vrlo su aktivni,
– aktivnost koncentriranih kultura može se kontrolirati prije upotrebe,
– njihova upotreba iziskuje manje rada i lakše se prilagođuje petodnevnom radnom tjednu,
– lakše se sprečava djelovanje bakteriofaga.
lako primjena koncentriranih startera u mljekarama ima više prednosti, treba dodati i neke loše strane njihove primjene (Gilliland, 1985), kao što su:
– ukoliko se radi o smrznutim koncentriranim starterima, dostava od proizvođača do korisnika je otežana;
– potrebno je osigurati odgovarajuće uvjete čuvanja tih kultura (temperature) zbog očuvanja aktivnosti;
– potreba kontrole kvalitete i aktivnosti u mljekarama;
– selekcija startera sa željenim proizvodnim karakteristikama nije više u proizvodnim pogonima, već pri proizvođaču kultura; i
– nije moguće proizvesti visokokvalitetne koncentrirane startere za sve fermentirane mliječne proizvode.

Tekuće kulture su do današnjih dana najčešći način primjene kultura u mljekarama. Kod tog načina mljekara upotrebljava tekući starter u svim fazama proizvodnje startera. Tekući starter mljekara nabavlja od proizvođača i aktivira ga kroz 2-3 precjepljivanja do svojeg proizvodnog startera. Taj način primjene startera ocijenjen je kao veoma skup. Starteri se tijekom brojnih inokulacija lako kontaminiraju ili inficiraju bakteriofagima. Također, za pripremu startera potrebno je odabrati spretno i posebno uvježbano osoblje.

Iz navedenih razloga nastoji se posljednjih godina što je moguće ijeđe upotrebljavati tekuće startere, tj. nastoji ih se upotrebljavati samo tamo gdje se ne mogu upotrebljavati koncentrirani starteri (mali opseg proizvodnje).

Osim tekućih kultura, mljekare mogu nabavljati i liofilizirane ili osušene duboko smrznute kulture za proizvodnju svojih proizvodnih kultura. To su veoma stabilne kulture i mogu se očuvati duže vrijeme (6 mjeseci pri -25 °C ili 3 mjeseca pri 6 °C). Ako mljekara upotrebljava osušene startere, moguće je da nabavi veće količine kulture, tj. za duži period proizvodnje.

Proces liofilizacije može se primijeniti za mnoge kulture mliječno-kiselog vrenja, ali se mnogi miješoviti starteri ne mogu izravno liofilizirati, jer se ravnoteža između sojeva bitno mijenja. To je osobito izraženo kod kultura koje sadrže kvasce ili plijesni. Prema Merilainenu (1988), ta se nepovoljnost može izbjeći ako se za uzgoj startera upotrijebe posebne temperature prije liofilizacije. Također je moguće sojeve odvojeno liofilizirati i kasnije sastaviti žeIjenu smjesu sojeva u starteru.

Smrznute kulture se u mljekarskoj industriji upotrebljavaju kao koncentrirani smrznuti starteri za pripremu proizvodnog startera i koncentrirani smrznuti starteri za izravnu proizvodnju (prikazano na slici 23). Tehnologiju koncentriranih starter kultura detaljno su opisali mnogi autori (G i 11 i 1 a n d, 1985; Tamime i Robinson, 1985), a glavne faze u proizvodnji su:

– priprema inokuluma,
– priprema uzgojne podloge,
– inokulacija u fermentoru,
– inkubacija pri konstantnom pH,
– izdvajanje bakterijskih stanica iz kulture,
– suspenzija izdvojenih stanica u kriogenu otopinu,
– smrzavanje koncentriranih stanica,
– pakiranje gotove koncentrirane kulture,
– skladištenje.

Starteri se najčešće (u proizvodnji koncentriranih startera) uzgajaju u proteinazom obrađenom mlijeku ili u podlogama koje su obogaćene dodatkom sirutke. U novije vrijeme upotrebljava se i permeat dobiven nakon ultrafiltracije sirutke.

Pripremljenu uzgojnu podlogu potrebno je sterilizirati, a nepromijenjeni pH potrebno je održavati da se razvije maksimalni broj stanica. Za izdvajanje stanica iz uzgojne sredine upotrebljava se ultracentrifuga. Smrzavanje izdvojenih stanica najosjetljiviji je dio u procesu proizvodnje. Proces smrzavanja može oštetiti staničnu stijenku bakterija, ali se ta oštećenja mogu smanjiti dodatkom različitih kriogenih tvari. U tablici 40. prikazan je učinak nekih otopina na preživljavanje pojedinih bakterija mliječno-kiselog vrenja.

Tablica 40. Učinak odabranih kriogenih tvari na preživljavanje duboko smrznutih bakterija mliječno-kiselog vrenja (kao % broja živih stanica) (adaptirano po Robinsonu, 1983)

Izostavljeno iz prikaza

Mikroorganizam L-glutaminska kiselina
S. lactis subsp. cremoris 40-60
S. lactis 31-74
S. lactis subsp. diacetylactis 44-53
L. delbrueckii subsp. bulgaricus 16-21
L. helveticus 48
L. acidophilus 42-63
L. casei 42-49
S. thermophilus 35-40
Mikroorganizam L-arginin
S. lactis subsp. cremoris 42-60
S. lactis 36-53
S. lactis subsp. diacetylactis 48-54
L. delbrueckii subsp. bulgaricus 20-35
L. helveticus 35
L. acidophilus 39-57
L. casei 28-40
S. thermophilus 21-40
Mikroorganizam L-lizin
S. lactis subsp. cremoris 1-16
S. lactis 0-7
S. lactis subsp. diacetylactis 4
L. delbrueckii subsp. bulgaricus 1-10
L. helveticus 23
L. acidophilus 4-38
L. casei 6-10
S. thermophilus 6-7
Mikroorganizam DL-treonin
S. lactis subsp. cremoris 20-39
S. lactis 8-39
S. lactis subsp. diacetylactis 14-37
L. delbrueckii subsp. bulgaricus 6-10
L. helveticus 14
L. acidophilus 6-21
L. casei 6-9
S. thermophilus 7-11
Mikroorganizam Acetilglicin
S. lactis subsp. cremoris 48-59
S. lactis 10-56
S. lactis subsp. diacetylactis 38-43
L. delbrueckii subsp. bulgaricus 7-23
L. helveticus 32
L. acidophilus 3-35
L. casei 4-18
S. thermophilus 29-44

Brojni istraživači proučavali su različite sastave podloga, dodatke i tehnike kako bi utvrdili optimalne uvjete pri proizvodnji koncentriranih duboko smrznutih kultura. Pregled nekih odabranih radova nalazi se u tablici 41.

Tablica 41. Izbor nekih kriogenih tvari duboko smrznutih kultura i hranjivih podloga koje se upotrebljavaju u proizvodnji

Izostavljeno iz prikaza

Način pripreme
Test organizam
Izvor podataka
obrano mlijeko + 1% peptoniziranog mlijeka+ 10% saharoze. koncentrirano mlijeko (20-25% suhe tvari) starter + mlijeko + sirilo.
biomasa u sirutki + obrano mlijeko + 10% saharoze + 1-2% Na-glutamata. S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus Gavin (1968)
suspendirati mješoviti sirarski starter u 7% laktoze ili 0,06 M mono-Naglutamata ili 0,06 M arginin-monohidro klorida S. lactis/S. lactis subsp. cremoris
S. lactis subsp. diacetylactis, L. cremoris Pettersson (1975)
uzgoj kulture u hranjivoj podlozi s mlijekom (pH 6,0-6,5) + dodaci (askorbinska kiselina, mono-Na-glutamat, smjesa aspartata) + krio − zaštitna sredstva (inozitol, sorbitol, manitol, glukoza, saharoza, kukuruzni sirup, škrob, maltoza, mono − ili disaharidi) patent za proizvodnju startera Porubcan i Sellars (1975)
suspendirati koncentrirane kulture u GCGS (5% želatine +5% Na-citrata + 2% mono-Na-glutamata +10% saharoze S. lactis, S. lactis subsp. cremoris, S. lactis subsp.
diacetylactis, Leuconostoc spp., Propionibacterium spp. Speckman (1975)
uzgoj kulture u obranom mlijeku (11% suhe tvari) +0,1% Tween 80, suspendirati biomasu u 6%-tni sladni ekstrakt S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus
razvoj laktobacila u MRS tekućoj podlozi + 10% (g/v) krio − zaštitnih tvari (laktoza, sladni ekstrakt, suha tvar mlijeka, mono-Na-glutamat, sirutkin prah ili peptonizirano mlijeko) L. delbrueckii subsp. bulgaricus L. acidophilus K. i l a r a i sur. (1976)
razvoj bakterija mliječno-kiselog vrenja u uzgojnoj sredini s niskim sadržajem laktoze, uz dodatak sojinih proteina i kazeina (0,13-0,26% g/g), smjesa se neprestano
puferira i zamrzava kod određene željene koncentracije bakterijskih stanica u podlozi starter mliječno-kiselog vrenja H u p i Stadhouders (1977)
susprendirati isprane stanice u obrano mlijeko (10% suhe tvari) +0,5% askorbinske kiseline +0,5% tiouree +0,5% amonijevog klorida. S. lactis, S. lactis subsp. cremoris,
S. lactis subsp. diacetylactis, L. cremoris, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, S. lactis, Bif. bifidum S i n h a i sur. (1970); S i h n a i sur. (1974) suspendirati koncentrirane kulture u otopinu saharoze + sol za puferiranje + želatina + Na-glutamat. Smjesa sojeva za sirarsku proizvodnju i proizvodnju maslaca
Bannikova i Lagoda (1970) uzgoj kulture u hidroliziranom mlijeku obogaćenom s 5% Difco kvaščevog ekstrakta ili 3% vodenog ekstrakta od kukuruza +0,012% MnSO4, MgSO4 i ZnSO4 + glukoza ili B-D-galaktozidaza; kontinuirana neutralizacija, suspenzija stanične biomase u obrano mlijeko (10% suhe tvari). .8. lactis, S. lactis subsp. cremoris, S. lactis subsp. diacetylactis K o r n a c k i i sur. (1974) rast kulture u rekonstituiranom mlijeku u prahu (10% suhe tvari), puferirano na pH 6,9.
za streptokoke: +ekstrakt kvasca i E-vitamin.
za laktobacile: + ekstrakt kvasca, Tween 80 i sirutka od ovčjeg mlijeka S. lactis, S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus Naghmoush i sur. (1978)
uzgoj kultura u obranom mlijeku (11% suhe tvari)+10% fi-glicerofosfata. S. lactis, S. lactis subsp-. cremoris Y an g i S a n d i n e (1978, 1979)
rast kulture u obranom nlijeku + 1,5% Na-glutamata i 8% sukroze. S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus Ozlap i Ozlap (1979)
uzgoj kulture na proteinazom razgrađenom mlijeku + ekstrakt kvasca + laktoza uz konstantan pH (dodavanje NH3)
koncentracija uz pomoć centrifugiranja, bakterijske stanice + zaštitni sastojci sirarski starteri B o u i 11 an e i Auclair (1978)
Starter kulture + 10%-tna otopina šećera ili 5-10% otopina peptona ili polimera 1500. .S. thermophilus. L. delbrueckii subsp. bulgaricus N i k o 1l o v a (1979)

Za smrzavanje koncentrata kultura zaštićenih kriogenim tvarima upotrebljava se tekući N,. Za većinu starter bakterija naglo zamrzavanje, koje se postiže primjenom tekućeg N2, metoda je koja osigurava najbolje preživljavanje bakterijskih stanica. Duboko smrznuti koncentrati kultura vrlo dobro se čuvaju: 6 mjeseci pri -196°C bez ikakavih promjena. Kulture se ne smiju odmrznuti prije nego što će se upotrijebiti, jer gube aktivnost. Duboko smrznute kulture čuvaju se u tekućem N2 i tako se šalju mljekarama. U novije vrijeme, za kraće udaljenosti od proizvođača kulture do mljekare upotrebljava se suhi led, te mljekare mogu čuvati smrznute kulture i pri -40°C nekoliko mjeseci.

Kao što je već rečeno, najveća poteškoća kod primjene smrznutih kultura je njihova otprema do korisnika. I vrijeme potrebno za kontrolu kvalitete smrznutog startera jedna je od poteškoća kod primjene navedenih startera. Međutim, važno je osigurati sigumu proizvodnju, osobito u većim mjekarama koje proizvode velike količine fermentiranih mliječnih proizvoda.

Posljednji napredak u primjeni starter kultura bilo je uvođenje osušenih duboko smrznutih koncentriranih startera u mljekarsku preradu. U osnovi, njihova proizvodnja je jednaka proizvodnji duboko smrznutih koncentriranih startera, ali ti starteri sušenjem nakon dubokog zamrzavanja postaju daleko lakše primjenjljivi i njima se lakše rukuje kod dostave. Broj bakterija mliječno-kiselog vrenja u osušenom starteru može doseći i 10Vg, dok u dubokosmrznutom iznosi 1010/g. Njihova aktivnost je takva da je 10-12 g koncentrata dovoljno za inokulaciju 1000 litara mlijeka. Najvažnija karakteristika tih startera je što se mogu čuvati pri sobnim temperaturama. Osušeni duboko smrznuti koncentrirani starteri obično se u mljekarama čuvaju u hladioniku (+ 8°C) do 5 mjeseci.

Mnoge u svijetu poznate tvrtke ili specijalizirani laboratoriji odnosno mljekarski instituti proizvode starter kulture. U tablici 42 navedeni su najpoznatiji proizvođači mljekarskih kultura.

Tablica 42. Najpoznatiji proizvođači mljekarskih kultura u svijetu

Izostavljeno iz prikaza

Komercijalni proizvođači
Chr. Hansens Laboratories Danska, SAD, Francuska
Miles/Marshall SAD, Francuska
Wisby SR Njemačka, Danska
Microlife Technich SAD
Erozyme Francuska
Flora Danica Danska
Centro Sperimentaie del Latte Italija
Lactolabo Francuska
Mljekarski instituti
C.S.I.R.O. Australija
New Zealand Dairy Res. Institute Novi Zeland
NIZO Nizozemska
Jouy-en-Josas Francuska
Liebefeld Švicarska

1.1. Priprema proizvodnih kultura za fermentirane mliječne napitke

Priprema proizvodne (radne) kulture zauzima veoma važno mjesto u tehnološkom postupku proizvodnje fermentiranih mliječnih napitaka. Metode pripreme različite su u različitim mljekarskim pogonima, mada se sve više u svijetu primjenjuje metoda direktne inokulacije s koncentriranim starterima. Proces proizvodnje radne kulture sastoji se od više faza, a svakoj fazi u proce

su treba posvetiti podjednaku pažnju, jer o tome ovisi kvaliteta proizvodne kulture.

Na slici 24. prikazane su faze u pripremi kulture.

Prostorije, pribor, uredaji i način rada kontrola kakvoće

Slika 24. Različite faze u pripremi proizvodnog startera

Izostavljeno iz prikaza

Za pripremu proizvodne kulture u mljekari tradicionalno se upotrebljava mlijeko. Punomasno mlijeko osigurava bolji okus i miris i bolju viskoznost, te manje izdvajanje sirutke iz kulture. Ako se za proizvodnju upotrebljava obrano mlijeko, pogreške mirisa i okusa lakše se otkrivaju. Za pripremu proizvodnog startera preporuča se upotreba skupnog mlijeka, što osigurava manje varijacije kvalitete mlijeka i manje koncentracije antibiotika i detergenata od pojedinačnog mlijeka. Za standardizaciju sastava mlijeka namijenjenog proizvodnji startera može se upotrebljavati i obrano mlijeko u prahu.

Kvaliteta mlijeka za proizvodnju proizvodnih kultura mora biti slijedeća:

– odabrano, prvoklasno mlijeko,
– test koagulacije mora pokazati homogeni koagulum,
– okus, miris i boja svojstveni i bez stranih primjesa,
– ne smije sadržavati mikroorganizme koji inhibiraju rast bakterija mliječno-kiselog vrenja,
– ne smije sadržavati antibiotike,
– broj sporotvornih bakterija < 10/g,
– relativno visoka količina suhe tvari bez masti,
– normalna količina citronske kiseline, oko 2,2 g/l (A n o n, 1983),
– dovoljno minerala, posebno Mn2+ i vitamina (A n o n, 1983).

izbor mlijeka
ili podloge
izbor kultura
cijepljenje mlijeka
hlađenje 1-2 h
primjena
skladištenje
inkubacija
30 do 60 min
90 do 95 °c
toplinska obrada
kontrola kakvoće

U modernim mljekarskim pogonima se za proizvodnju proizvodne kulture za fermentirane mliječne napitke sve više upotrebljava obrano mlijeko u prahu. Razlog tome je da je moguće prije proizvodnje kulture detaljno ispitati mlijeko. Na taj se način eliminiraju i moguća dnevna promjenljivost mlijeka i prisutnost antibiotika ili detergenata u mlijeku.

Kvaliteta obranog mlijeka u prahu za pripremu proizvodnog startera mora biti strogo određena:

– mlijeko u prahu prizvedeno od sirovine koja je toplinski obrađena pri niskim temperaturama (»low-heat«),
– besprijekoran okus, miris i izgled,
– pH rekonstituiranog mlijeka 6,7-6,75,
– bez taloga,
– do 4% vode,
– kod testiranja aktivnosti krajnji pH, dobiven inokulacijom sa standardnim starterom nakon 4 sata inkubacije pri 30°C, mora imati najmanje 16°SH (Anon, 1983),
– koliformni mikroorganizmi < 1/g,
– kvasci i plijesni < 1/g,
– bez inhibitornih tvari,
– broj živih bakterija < 1000/g (Anon, 1983),
– broj termorazistentnih bakterija < 100/g (A n o n, 1983).

Za postizanje boljeg rasta startera u obranom mlijeku sve češće se odabrano mlijeko obogaćuje različitim aktivatorima rasta. Bolji rast kulture postiže se povećanjem suhe tvari mlijeka. Također se sve češće dodaju u mlijeko aktivatori rasta kao: kvaščev ekstrakt, ekstrakt pankreasa, hidrolizat proteina, citronska kiselina, mangan i dr. Dodaju se i neke komercijalne mješavine što ih proizvođači stavljaju na tržište pod imenom bioaktivatori, koji se dodaju u mlijeko za pripremu proizvodnog startera za fermentirane mliječne napitke u slučaju kad se vjeruje da je mlijeko loše kvalitete s obzirom na nedostatak tvari rasta.

Za inhibiciju razvoja faga u proizvodnim kulturama za fermentirane mliječne napitke sve se češće upotrebljava podloga od obogaćene sirutke u kojoj se može održavati stalni pH, tj. s dodacima za puferiranje (Huggins, 1984).

Za proizvodnju aktivnog (mikrobiološki ispravnog i bez bakteriofaga) startera treba osigurati kvalitetnu matičnu i laboratorijsku kulturu (T a m i m e i Robinson, 1985). Između prostora gdje se proizvode matične i laboratorijske kulture i prostora za uzgoj proizvodnog startera ne smije biti izravnog kontakta. I osoblje za proizvodi kulture mora biti izdvojeno od osoblja koje radi u prizvodnim prostorima. U prostorima za pripremu kultura zrak treba filtrirati (W i g 1 e y, 1980).

Za precjepljivanje matičnih i laboratorijskih kultura upotrebljava se više mehaniziranih naprava. Tamime i Robinson (1985) opisali su više takvih naprava. Najčešće su u primjeni, prema istim autorima, slijedeće:

– Lewis sistem
– Alfa-Laval sistem
– Tertlet-Zutphen sistem
– Jones sistem.

B − medukultura
C -proizvodna kultura
D-detalj naprave za precjepljivanje

Slika 25. Shematski prikaz Lewisovog sistema za aseptičko precjepljivanje kultura

Izostavljeno iz prikaza

Kod uzgoja proizvodnih kultura vrlo je važno obratiti pažnju na:

Pasterizaciju mlijeka: Općenito se primjenjuje grijanje mlijeka na 90°C kroz 15-45 minuta, što ovisi o vrsti kulture.

Inokulaciju: Ovaj dio proizvodnog procesa kod pripreme proizvodnog startera vrlo je rizičan zbog mogućnosti kontaminacije. Potrebno je pročišćavati zrak u prostorima tj. ubacivati sterilizirani zrak (Huggins, 1984). Također, proizvođači opreme za tu vrstu mljekarske proizvodnje uvode posebnu opremu za aseptičko nacjepljivanje kultura.

Čišćenje i sanitaciju: Potrebno je kvalitetno ClP-sistem pranje (optočno) i sterilizacija otopinom hipoklorita ili vodenom parom.

Grijanje i hlađenje: Potrebna je pažljiva regulacija temperature kod grijanja i hlađenja koje se odvija preko dvostruke stijenke duplikatora za proizvodnju kulture.

Kod uzgoja proizvodnog startera, gdje se upotrebljava rekonstituirano mlijeko, dodatna oprema je i uređaj za rekonstituciju mlijeka u prahu.

1.2. Priprema proizvodnih kultura u sirarstvu

Za uzgoj proizvodnih kultura u proizvodnji sireva potrebno je, kao i kod već opisane pripreme proizvodnih kultura za fermentirane mliječne mapitke, posebnu pozomost obratiti izboru sirovine za proizvodnju, obradi sirovine, poboljšanju kvalitete sirovine, održavanju higijene i ostalo. Posebna pažnja pri proizvodnji sirarskih proizvodnih kultura poklanja se problemu infekcije kulture fagima.

Rješenje problema je ponajprije u izboru fag-rezistentnih kultura, kako je već navedeno.

Od postupaka koji se primjenjuju u proizvodnji startera treba spomenuti grijanje uzgojne podloge na 95 °C, zbog inaktivacije faga, sterilizacije poklopca duplikatora i ubacivanja steriliziranog zraka u prostor za pripremu kulture. Primjenom posebnih uređaja koji omogućuju inokulaciju mlijeka (tradicionalnim starterom i koncentriranim starterom) bez kontaminacije, postiže se veća sigurnost u toj proizvodnji. Na slici 26 shematski je prikazan duplikator za pripremu proizvodne kulture.

U proizvodnji sireva, posebno u SAD, sve se češće za proizvodnju startera upotrebljavaju specijalne uzgojne podloge, tzv. PIM-podloge. PIM-podloge sadržavaju fosfatne soli koje inhibiraju rast bakreriofaga. Ove su podloge visoko puferirane, što poboljšava aktivnost startera. Za uzgoj kvalitetne proizvodne kulture posebno je važna kontrola trajanja i temperature inkubacije odnosno hlađenja.

Uvođenjem stalne kontrole pH-vrijednosti hranjive podloge u procesu uzgoja startera značajno se povećava ne samo aktivnost startera, već i mogućnost njegovog dužeg čuvanja. Richardson i sur. (1980), i Richardson (1985) za proizvodnju sirarskih proizvodnih kultura preporučuju uzgojnu podlogu od sirutke, a dodavanjem NH3 osigurava se potrebna neutralizacija. Ovaj postupak, koji ima i ekonomske prednosti, sve se više primjenjuje u SAD, a i ostale zemlje pokazuju interes za njegovu primjenu.

Upotrebu uzgojnih podloga s unutrašnjom kontrolom pH-vrijdnosti, tj. podloge koje sadrže pufer tvari koje održavaju pH uzgojne podloge na pH 5,2 prvi su predložili (i predložili sastav podloge) Willrett i sur. (1982) te Sandine i Ayres (1983).

Prednost upotrebe pH-kontroliranih uzgojnih podloga je i u tome što se u sirarstvu mogu upotrebljavati i »spori« sojevi (koji su često fag-osjetljivi). Posebnu pažnju, s obzirom na infekcije fagom u sirarskim pogonima, potrebno je obratiti na higijenu, posebno u proizvodnji kultura. Sirne kade i ostala oprema moraju se klorirati nakon svakog procesa proizvodnje, a sirutka se treba pažljivo iznositi iz pogona. U sirarskim pogonima, gdje postoji sumnja na infekcije fagom, potrebno je osigurati kontroliranu izmjenu zraka i primijeniti sprejeve na bazi klora, što umanjuje mogućnost infekcije fagom.

Proizvodna sirarska kultura ima znatan utjecaj i na randman sira (H i c k s i sur., 1985; T h u n e 11, 1986). Banks i sur. (1985) zapazili su da se oko 40% suhe tvari startera zadržava u siru i da je randman sira bio znatno veći ako je starter proizveden u obranom mlijeku nego ako je korišten koncentrirani starter za izravno cijepljenje mlijeka u sirarskoj kadi. Nasuprot tome, Hicks i sur. (1985) i Ustinol i sur. (1986) utvrdili su povećanje randmana sira kod upotrebe direktnog cijepljenja mlijeka koncentriranim starterima ili uzgojem proizvodnog startera u podlozi sa sirutkom pri stalnom pH. Povećanje randmana kod proizvodnje sira utvrđeno je i kod primjene kultura uzgajanih na UF-retentatu (Mistry i Kosikovvski, 1986).

Problem oko povećanja prinosa sira (s obzirom na vrstu kulture) zaslužuje da bude sasvim riješen (osobito je to važno za velike proizvođače sira), što znači da je potrebno točno definirati način uzgoja proizvodne kulture.

1.3. Važne faze u procesu pripreme proizvodne kulture

Najvažnije faze u procesu pripreme proizvodne kulture u mljekari su: toplinska obrada mlijeka, trajanje fermentacije, temperatura fermentacije i držanje kulture. Također, posebna pažnja mora se obratiti izboru kulture, što i nije teško, jer niz proizvođača nudi komercijalne mljekarske kulture.

Toplinska obrada mlijeka je osnovna operacija u pripremi proizvodnog startera, jer poboljšava svojstva mlijeka kao uzgojne sredine. Toplinskom obradom mlijeka osigurava se slijedeće (M e r i 1 a i n e n, 1988):

– inaktivacija nepoželjnih mikroorganizama i bakteriofaga u mlijeku,
– inaktivacija prirodnih baktericidnih tvari u mlijeku (imunoglobulini, sistemi laktoperoksidaze, laktoferin i lizozim),
– reducira se oksido-redukcijski potencijal mlijeka, jer tijekom grijanja O2 izlazi iz mlijeka,
– denaturiraju se proteini mlijeka, pa se poboljšava iskorištavanje N-sastojaka iz mlijeka za bakterije iz sastava kultura, koje bolje rastu,
– neki sastojci mlijeka prelaze u oblik koji mikroorganizmi lakše upotrebljavaju
– dobiva se bolja viskoznost kulture, jer sirutkini proteini bolje vežu vodu.

Kod toplinske obrade mlijeka u pripremi proizvodnih kultura najčešće se primjenjuju slijedeći načini grijanja mlijeka:

– 90-95 °C kroz 15-30 min u duplikatorima za proizvodnju kultura
– HTST pasterizacija (95 °C/1 min ili više), i
– 110-115 °C kroz 15-20 min u autoklavu (samo u nekim slučajevima).

Poznato je da prejaka toplinska obrada mlijeka može biti uzrokom inhibicije rasta bakterija. Jedan od uzroka je prevelika količina izdvojenih SH-skupina, koje zatim prelaze u sulfide. Moguća je i kemijska reakcija aminokiselina i s laktozom koja je, kako je poznato, faktor rasta za bakterije u sastavu radnog startera.

Za inokulaciju proizvodne kulture moraju se osigurati aseptični uvjeti i primijeniti određeni postupci:

– inokulacija se izvodi sa steriliziranim priborom (121 °C/20 min u autoklavu ili 120°C/2-4 h, suha sterilizacija),
– kulturu (inokulum) treba prije inokulacije dobro promiješati,
– kontaminacija će biti jedva moguća ako se inokulacija izvede brzo, jer je posuda (duplikator) u tom slučaju samo kratko otvorena.

Trajanje i temperatura inkubacije startera ovise o svojstvima startera (spori/brzi sojevi) i kvaliteti startera, te o količini inokuluma. Količina inokuluma najčešće je od 0,5 do 2,0% ako se koriste tekući starteri. Međutim, ako se uzimaju duboko smrznuti koncentrirani starteri, količina inokuluma je 0,007%, a kod upotrebe sušenih duboko smrznutih koncentriranih startera 0,001%.

Kod pripreme proizvodnih startera trajanje i temperatura inkubacije moraju biti toliko točno održavani koliko je to moguće postići, da bi se osigurali optimalni uvjeti za rast kulture.

Proizvodne kulture čuvaju se pri temperaturi 4 °C i njihove karakteristike (aktivnost) se ne mijenjaju u tijekom 24 do 48 sati.

Temperatura inkubacije (a i trajanje) su različiti za različite kulture:

– termofilne kulture: 42-44 „C/2-3 sata (npr. jogurt),
– mezofilne kulture: 19-21 °C/15-18 sati (npr. kvark, buttermilk).

Naravno, starteri za različite vrste fermentiranih mliječnih proizvoda imaju svaki za sebe svoj optimum rasta. Stalno mijenjanje temperature inkubacije utječe na promjenu sastava startera. Kod mezofilnih DL-startera, npr., utvrđeno je da količina bakterija koje fermentiraju citrat raste ako se temperature inkubacije povise od 18 °C na 24° C (Lode i Tufto, 1973). Takve promjene u sastavu kultura nisu utvrđene kod L-kultura. Promjene temperature inkubacije nisu, međutim, utjecale na količinu proizvedene kiseline.

Abrahamsen (1977) je utvrdio da je produljena inkubacija DL-kulture iznad 18 sati utjecala na smanjenje broja živih bakterija u ml kulture i na smanjenje broja bakterija koje fermentiraju citrate. Važno je ovdje dodati da su kod uzgoja startera kličina inokuluma, temperatura inkubacije i trajanje fermentacije u uzajamnoj ovisnosti. Nakon završene fermentacije kulturu je potrebno ohladiti što je moguće brže na 4 do 5 °C, jer držanje kulture na višim temperaturama mijenja količinu i odnos bakterija u sastavu kulture, koncentraciju i strukturu aromatičnih tvari.

Vrijeme čuvanja proizvodnih kultura ograničeno je, jer kultura gubi svoju aktivnost. Jedan i pol dan pri temperaturi od 5 °C krajnji je rok čuvanja startera. Za duže čuvanje startera preporuča se smrzavanje startera (malih količina, naravno). Preporuča se nacjepljivanje 1% aktivnog startera u sterilizirano ili pasterizirano mlijeko i smrzavanje pri -30 °C do -40 °C. Na ovoj temperaturi starter se može čuvati nekoliko mjeseci (M e r i l a i n e n, 1988).

Mikrobne kulture u proizvodnji mliječnih proizvoda

Sadržaj

Uvod

I. Klasifikacija mljekarskih kultura

II. Genetičko inženjerstvo bakterija namijenjenih proizvodnji fermentiranih mliječnih proizvoda

III. Taksonomija i metabolizam mikroorganizama važnih za proizvodnju fermentiranih mliječnih proizvoda

1. Kulture za fermentirane mliječne napitke

1.1. Razlike između bakterija mliječne kiseline i drugih srodnih vrsta

1.1.1. Rod Lactobacillus

1.1.2. Rod Streptococcus

1.1.3. Rod Leuconostoc

1.1.4. Rod Pediococcus

1.1.5. Rod Bifidobacterium

1.1.6. Ostali mikroorganizmi u fermentiranim mliječnim napicima i njihova taksonomija

1.1.6.1. Rod Acetobacter

1.1.6.2. Kvasci

1.1.8. Metabolizam proteina u bakterija mliječno-kiselog vrenja

1.2. Mezofilne kulture za fermentirane mliječne napitke

1.2.1. Neka posebna i tehnološka svojstva mezofilnih kultura

1.2.2. Faktori koji utječu na rast i aktivnost mezofilnih kultura

Bakteriofagi

1.3. Termofilne kulture za proizvodnju fermentiranih mliječnih napitaka

1.4 Kulture za proizvodnju kefira i kumisa

1.4.1. Kulture za proizvodnju kefira

1.4.2. Kulture za proizvodnju kumisa

1.4.3. Metabolizam mikroflore kefira i kumisa

1.5. Kulture koje sadržavaju intestinalne bakterije

1.5.2. Selekcija i biokemijska svojstva intestinalnih bakterija

1.5.3. Kriteriji za selekciju bakterija namijenjenih proizvodnji dijetetskih mliječnih napitaka

1.5.4. Faktori koji utječu na održavanje kultura

1.5.5. Načini nabave i distribucija kultura, te pregled pripreme kultura sa selekcioniranim intestinalnim bakterijama

2. Kulture za proizvodnju sireva

2.1. Identifikacija bakterija važnih za proizvodnju sireva

Bakterije propionske kiseline

Brevibakterije

2.2. Kulture i njihov utjecaj na mikroorganizme kontaminante u siru

2.3. Primjena kultura u proizvodnji sira

2.4. Karakteristike nekih poznatijih vrsti sireva i sastav kultura za njihovu proizvodnju

Učinak kulture u proizvodnji nekih vrsti sireva

Tvrdi sirevi

Ementaler

Polutvrdi sirevi

Edamer i Gouda

Sirevi s površinskim bakterijskim rastom

Sirevi s plijesnima u unutrašnjosti sira

Sirevi s razvojem plijesni na površini sira

Svježi sirevi

»Pasta filata« sirevi

Ostali sirevi

Cottage sir

Quark

2.5. Razvoj arome u sirevima

2.5.1. Uloga ugljikohidrata u tvorbi arome sira

2.5.2. Uloga mliječne masti u procesu stvaranja arome sira

2.5.3. Uloga proteina mlijeka u tvorbi arome sira

Proteoliza

2.5.3.1. Razgradnja aminokiselina

2.5.3.2. Proteoliza i mane sirne arome

IV. Proizvodnja mljekarskih kultura

1. Način primjene kultura

1.1. Priprema proizvodnih kultura za fermentirane mliječne napitke

1.2. Priprema proizvodnih kultura u sirarstvu

1.3. Važne faze u procesu pripreme proizvodne kulture

Napišite komentar

Registrujte se