Veterinarska higijena kao primenjena nauka nužno mora pojedinim pitanjima da prilazi analitičkim metodom. Ovo dolazi do izražaja naročito pri postavljanju izvesnih higijenskih normi i pravila. No, isto tako, što se čak i vrlo često događa, veterinarska higijena odnosno higijeničar susreće se sa pojavama koje predstavljaju odstupanje od pomenutih normi i pravila. Pred higijeničare se u tom slučaju postavlja ne samo pitanje tačnog određivanja kvaliteta odstupanja, već i iznalaženje puteva kako da se nastale higijenske anomalije što pre odstrane. To opst u krajnjem slučaju znači vođenje borbe za saniranje zdravlja i vraćanje proizvodnih sposobnosti životinja.

Ovo zahteva od veterinara, a naročito od zoohigijeničara, ne samo poznavanje teoretskih postavki veterinarske higijene već i izvesno znanje i rutinu u „seciranju“ da se tako izrazimo iskrslog problema. Samo temeljna analiza čitavog kompleksa određenih faktora može da nam ukaže pravilan put u rešavanju pojedinih higijenskih pitanja.

Kako su osnovni pojmovi za pojedina pitanja objašnjeni u udžbenicima veterinarske higijene to ćemo se mi njima u Praktikumu služiti kao poznatim činjenicama, ne ulazeći u njihovo ponovno tumačenje. Zadržaćemo se naprotiv na putevima koji nam omogućavaju stvaranje pravovaljanih zaključaka o pojedinim higijenskim kvalitetima.

Ovaj Praktikum i ima upravo zadatak da nas upozna sa najosnovnijim metodama i načinima rada u toj higijenskoj analizi. U našim izlaganjima govorićemo, uglavnom, samo o onim metodama koji imaju neko značenje za našu veterinarsku praksu i koji su nam, prema našoj tehničkoj opremi, pristupačni. Ostale metode ćemo eventualno samo pomenuti.

U obradi ovog Praktikuma služili smo se u obilnoj meri, a često i doslovno našom domaćom i stranom literaturom kao i iskustvima nekih sanitamih laboratorija naših humanih higijenskih zavoda.

Dr Ivan Puhač

Sadržaj

PREDGOVOR

I. HIGIJENSKO ISPITIVANJE ZEMLJIŠTA

Pregled terena
Fizičke osobine zemljišta
Granulometrijski sastav zemljišta
Specifična težina
Poroznost
Vodeni kapacitet zemlje
Sposobnost usisavanja vode kapilarama
Temperatura zemlje
Hemijsko ispitivanje zemlje
Bakteriološko ispitivanje zemlje
Izbor zemljišta za izgradnju raznih objekata

II. ISPITIVANJE VODE ZA NAPAJANJE I OTPADNIH VODA

Terenski pregled
Uzimanje j slanje ogleda
Ispitivanje fizičkih osobina vode
Temperatura
Miris i ukus
Boja
Mutež
Hemijska analiza vode
Rastvoreni ugljen dioksid
Rastvoreni kiseonik u vodi
„Kiseonik odmah“
Razlika kiseonika
Potrošnja kiseonika
Konsumpcija kiseonika
Azotna jedinjenja
Slobodni amonijak
Albuminoidni amonijak
Celokupni organski azot
Određivnje nitrata
Dokazivanje nitrata
Suvi ostatak
Dokazivanje gvožđa
Alkalitet
Određivanje hlora kao hlorida
Tvrdoća vode
Određivanje sulfat-iona (SO4)
Bakteriološki pregled vode
Određivanje sveukupnog broja klica
Određivanje klica koliformne grupe
Interpretacija rezultata bakteriološkog pregleda vode
Mikroskopsko-biološki pregled vode

III. ISPITIVANJE ATMOSFERSKIH I MIKROKLIMATSKIH FAKTORA

Ispitivanje fizičkih osobina atmosfere
Temperatura vazduha
Vlažnost vazduh
Kretanje vazdušnih masa – vetrovi
Ispitivanje mikroklimata
Toplotna okolina
Temperatura
Vlažnost
Brzina strujanja vazduha
Toplotno zračenje
Ekvivalentna temperatura
Efektivne i korigirane efektivne temperature
Ostali izrazi toplotne okoline
Analiza hemijskih sastojaka vazduha
Ugljen dioksid
Metoda po Pettenkoferu
Metoda po Puhaču
Metoda po Lunge – Zeckendorfu
Metoda sa carbacidometrom po Wolpertu
Amonijak
Sumporvodonik
Ispitivanje zaprašenosti vazduha
Utvrđivanje mikroorganizama u vazduhu

IV. IZGRADNJA I OCENA STAJA

Ispitivanje građevinskog materijala
Poroznost materijala
Sposobnost primanja i odavanja vode
Zapreminska težina
Određivanje vlažnosti zidova
Osvetljenje staja
Ventilacija u stajama

V. ISPITIVANJE DEZINFICIJENSA I NJIHOVA PRIPREMA ZA UPOTREBU

Ispitivanje baktericidne sposobnosti dezinficijensa
Suspenziona metoda (phenolni koeficijent)
Metoda svilenih niti
Metoda sa batistnim krpicama
Granatna metoda
Metoda sa pokrovnim stakalcem
Metoda prema Roddish-u
Ispitivanje hlornog kreča i pravljenje njegovih delotvornih rastvora
Jodometrijska metoda
Terenska metoda
Priprema rastvora

V Ispitivanje dezinficijensa i njihova priprema za upotrebu

Ispitivanje dezinficijensa ima izvanredan značaj za uspehe u praktičnom sprovođenju dezinfekcije. To se ne odnosi samo na dezinfekciona sredstva koja se prvi puta uvode u dezinfekciju. Ima dezinficijensa čiju dezinficirajuću sposobnost, iako su kao dezinficijensi ispitani, moramo češće da proveravamo. Ovo proveravanje i ispitivanje može da se kreće u pravcu utvrđivanja baktericidne sposiobnosti određenih dezinficijensa, ili opet na određivanje njihovih određenih hemijskih sastojaka, takozvanih aktivnih materija koje upravo i određuju dezinfekcionu sposobnost jedne materije.

Ispitivanje baktericidne sposobnosti dezinficijensa

Da bi se jedan dezinficijens mogao da koristi u svakidašnjoj praksi. mora da se prethodno ispita na baktericidnu sposobnost.

Ovo se ispitivanje sastoji u tome da raznim njegovim koncentracijama delujemo na određeni mikroorganizam i utvrđujemo efekat njegovog delovanja. Obično se za ispitivanje ove sposobnosti deluje dezinficijensom na predstavnike sporogenih bakterija najčešće na spore antraksa, kao i na predstavnika nesporogenih bakterija. Kao predstavnik ovih poslednjih, a ujedno i jedan od najotpornijih, uzirna se Staphylococus pyogenes auereus. No uz ove mogu da se koriste i drugi mikroorganizmi.

Posle delovanja dezinficijensa na određene bakterije zasejava se materijal u kome se ove nalaze u određenim vremenskim razmacima na gojilišta, stavlja u termostat kod 37° C i kroz više dana kontrolira rast kolonija.

Pritom treba da se vodi računa da se dezinficijensom deluje uvek na jednaki, po mogućstvu, broj bakterija i kod iste temperature. Obično se radi kod sobne temperature od 18° C.

Za ispitivanje baktericidne sposobnosti dezinficijencija postoji više metoda.

Suspenziona metoda po Rideal—Walker-u ili metoda pomoću određivanja phenolnog koeficijenta za jedan decinficijens. Ova se sastoji u tome da baktericidnu sposobnost jednog dezinficijensa na određeni mikroorganizam upoređujemo sa đelovanjem phenola na isti mikroorganizam. Kao test kultura uzima se b. typhi.

Postupak je sledeći: Prethodno se spremi 24 časa stara buljonska kultura. Istovremeno naprave se različita razređenja phenola kao i razna razređenja dezinficijensa kome želimo da odredimo phenolni koeficijent. Da se ne bi pravio veliki broj razređenja dobro je prethodno da se izvrši gruba orjentaciona proba na to koja približna koncentracija dezinficijensa i phenola ubija mikroorganizme iz priređene buljonske kulture. Sem toga mora da se pripreme i epruvete sa sterilnim buljonom.

Od pripremljenih rastvora dezinficijensa koji ispitujemo a isto tako i phenola uzimamo u epruvete po 5 ccm od svakog razređenja. Epruvete stavljamo obično na stalak, i to u jedan red sa razređenjem phenola a u drugi sa razređenjem ispitivanog dezinficijensa. Sada iz pripremljene buljonske kulture uzimamo 5 kapi i stavljamo u svaku od ovih epruveta (odnosno uzimajući u rad jedno po jedno razređenje). Nakon toga epruvetu promućkamo da bi se kultura što jednakomernije rasporedila po dezinficijensu kako bi se time omogućilio što bolje njegovo delovanje.

Sada od časa stavljanja kulture u dezinficijens svakih 2 1/2 minute sve do 15 minuta, to znači nakon 2 1/2, 5, 7 1/2, 10, 12 ½ i 15 minuta, uzimamo iz epruvete jednu ezu materijala i zasejavano na buljon. Ovaj stavljamo u termostat i posle 24 časa proveramo buljon na rast mikroorganizama sa kojima smo radili. Ovaj se postupak vrši sa svima razređenjima kako phenola tako i ispitivanog dezinficijensa.

Time mi zapravo tražimo onu minimalnu koncentraciju ispitivanog dezinfekcionog sredstva koja ubija mikroorganizme korištene kulture, kao i koncentraciju phenola koja izvodi isti efekat u isto vreme. Ako sada nađenu koncentraciju ispitivanog dezinficijensa podelimo sa odgovarajućom koncentracijom phenolnog rastvora dobijamo phenolni koeficijent ispitivanog dezinficijensa. Za ilustraciju neka nam posluži sledeći primer (Tabela 38).

pozitivan rast kultura na buljonu
negativan rast kultura na buljonu

Ispitivani dezinficijens ima phenolni koeficijent 900 / 90 = 10

Ovim ispitivanjem dezinficijensa dobijamo. dakle, relativnu vrednost za njegovu baktericidnu sposobnost izraženu uz pomoć phenola,

Pripremu različitih. koncentracija phenola i ispitivanog dezinficijensa vršimo na sledeći način. Najpre je potrebno da se napravi osnovno razređenje phenola, odnosno ispitivanog sredstva i to: 1:10 ili 1:100. Polazeći od ovog osnovnog spremamo druga željena razređenja. Potrebne vrednosti za pravljenje ovih razređenja dobijamo ako vrednost za željeno razređenje podelimo sa vrednosti osnovnog razređenja. Time dobijamo ukupnu količinu željenog razređenja (a) u kojem treba da bude 1 ccm osnovnog razređenja i a—1 ccm vode.

Napr. imamo osnovni 1:100 rastvor jednog sredstva koje ispitujemo, a želimo da napravimo 1:5000 rastvor. Ako podelimo 5000 (željena koncentracija) sa 100 (osnovna koncentracija) dobijamo 50. Ovaj nam broj označava količinu željenog rastvora, a ova se dobiva ako 1 ccm osnovnog rastvora dopunimo vodom do 50, znači ako 1 ccm rastvora dodamo 49 ccm vode. Ili imamo osnovni rastvor phenola 1:10, a treba da napravimo rastvor 1:115, to je 115:10 = 11,5. Da bi dobih 11,5 ccm željenog rastvora moramo uzeti 1 ccm osnovnog rastvora i 10,5 ccm (11,5—1) vode.

Metoda svilenih niti po R. Kochu. Ova se metoda sastoji u tome da se uzima beia svilena nit srednje debljine i iseče na komadiće 1—3 cm duge. Ovi se zamotani u filtar papiru sterilišu u autoklavu kod 160° C. Posle toga ove komadiće potopimo u Petrijevoj šolji kroz 30 minuta u određenoj suspenziji 24 časa stare kulture sa sterilnim fiziološkim rastvorom. Dobro je da se ova suspenzija prethodno filtrira kroz sterilizovan filtar papir kako bi se odstranile sve grublje čestice.

Posle navedenog vremena vadimo sa sterilnom pincetom ovako inficirane niti i stavljamo ih u drugu sterilnu Petrijevu šolju i pustimo da se one osuše (možemo malo otvorenu šolju staviti i u eksikator, da se brže osuše niti). Istovremeno pripremimo različite koncentracije rastvora sredstva kome želimo da ispitamo dezinfekcionu sposobnost. Rastvore razlijemo u Petrijeve šolje.

Pošto su se niti posušile uzimamo sada sterilnom pincetom po jednu ili više i potopimo ih u Petrijeve šolje sa raznim koncentraeijama rastvora ispitivanog sredstva. Sada u određenim vremenskim razmacima sterilnom pincetom ponovo vadimo niti, ispiremo ih dobro sa sterilnom fiziološkom ih destilovanom vodom, a zatim ih stavljamo u epruvete sa sterilnim buljonom. Nakon inkubacije u termostatu od 24—48 časova proveravamo buljion na rast mikroorganizama. Pošto znademo iz kojeg smo razređenja ispitivanog sredstva zasejali buljon, znaćemo već prema pozitivnom ili negativnom rastu ‘na buljonu koja koncentracija ispitivanog dezinficijensa ubija ili ne ubija određeni mikroorganizam.

Kod ove metode kao i kod drugih delovanja jednog sredstva ispitujemo na predstavnicima sporogenih i nesporogenih bakterija.

Kod ove metode. međutim, i pokraj ispiranja inficiranih niti sa sterilnom vodom na ovima može da se zadrži izvesna količina dezinficijensa koja se upila u nit i koja može da vrši produžno dezinficirajuće delovanje i posle pranja niti. Zato je preporučljivo kod ove metode, radi dobijanja tačnih rezultata, pre zasađivanja u buljon niti osloboditi od dezinficijensa. To se vrši na taj način što niti posle vađenja iz suspenzije stavimo kroz 3—5 minuta u određene hemijske rastvore koji će neutralisati ostatke dezinficijensa, a zatim isperemo sterilnom destilovanom vodom.

U tu svrhu kod dezinfekcije sa lužinama upotrebljava se 3% rastvor acidi borici, kod hlornih preparata n/10 rastvor natrium thiosulfata, kod živinih soli 3% rastvor amonium sulfata, kod bakarnih soli 3% rastvor amonium sulfata, kod phenola sterilna destilovana voda, kod kiselina 3% rastvor amonijaka i kod alkalija 3% rastvor sirčetne kiseline. Posleneutralizacije sa pomenutim sredstvima niti se ispiru u sterilizovanoj vodi, a zatim zasejavaju na buljon.

Metoda sa batistnim krpicama prema E. Hailer-u. Po ovoj metodi koristi se potreban broj batistnih krpica veličine 8×12 mm koje su prethodno u Petrijevoj šolji sterilizovane u autoklavu kroz 20 minuta na temperaturi od 120° C. Ovakve krpice zatim se urone kroz 15 minuta a suspenziju bakterijske kulture sa kojom radimo tako da budu potpuno pokvašene.

Pomenuta suspenzija dobija se na taj način da se 24 časa stara agar kultura ispere sa 15 ccm sterilne destilovane vode. Dobivena emulzija se zatim filtrira kroz sterilni 1 cm debeli sloj staklene vune. Na isti način dobiva se i suspenzija spora samo što se za ovo koriste kulture stare 3—4 dana. Pre filtracije splahnina spora se prethodno uz dodatak sterilnih staklenih zrnaca dobro promućka da bi se dobila homogena suspenzija.

Istovremeno pripremimo različite koncentracije dezinficijensa koje želimo da ispitamo i razlijemo ga u potreban broj sterilnih Petrijevih šolja. Sada platinastom pincetom uzimamo iz suspenzije kulture batistne krpice i mećemo ih vlažne u Petrijeve šolje sa dezinficijensom. Nakon određenih vremenskih razmaka, odnosno raznih ekspozicija krpice se vade iz dezinficinjesa, stavljaju kroz 3—5 minuta u neutralizirajući rastvor (vidi prednju metodu), a zatim ispiru u sterilnoj destilovanoj vodi. Posle toga krpice se stavljaju u epruvetu sa 12 ccm buljona, a ovo se zatim inkubira kroz 10 dana u termostatu na 37° C uz svakodnevnu kontrolu da li se pojavljuje rast mikroorganizama.

Granatna metoda prema Kronig-u i Paul-u. Kod ove metode mesto svilenih niti upotrebljavaju se granatna zrnca jednake veličine. U tu svrhu uzima se granat koji se prosije kroz sito od niklenog lima koje ima jednako velike rupice. Prosijani granat se zatim više puta iskuva u rastvoru 1 dela hlorovodonične kiseline i 3 dela destilovane vode. Prokuvani granat ispire se destilovanom vodom sve dok voda ne ostaje čista. Posle toga granat se ispere sa alkoholom, eterom i ponovo sa alkoholom, a zatim se po 180 komada osušenog granata stavlja u epruvete i sterilizuje 1 čas na 160″ C.

Ovako sterilizovanom granatu u epruveti dodaje se nekoliko kubika suspenzije kulture bakterija. Epruveta se zatim zatvara i sadržaj dobro mućka 15—30 minuta. Preostala suspenzija se zatim kapilarom odstranjuje iz epruvete. a zrnca granata se sipaju u sterilnu Petrijevu šolju i isušuju u tami u eksikatoru. Ovako osušena zrnca granata stavljaju se sada u razne koncentracije dezinfecijensa koji ispitujemo. Sada se u određenim vremenskim razmacima iz dezinficijensa vadi po 6 komada zrnaca. Ova stavljamo 3—5 minuta u odgovarajući rastvor za neutralizaciju, a zatim ispiremo sa sterilnom destilovanom vodom. Granatna zrnca tada stavljamo u epruvetu sa 1 ccm sterilne destilovane vode. Epmveta se zatim snažno mućka da bi se dobila suspenzija još eventualno zaostalih bakterija na zrncima granata. Ovoj suspenziji se sada dodaje 12 ccm otopljenog i na 50° C ohlađenog agara, a zatim se ovo izlije u Petrijevu šolju i inkubira kroz 48 časova na 37° C.

Metoda sa pokrovnim stakalcem prema Jensen-u koristi mesto niti,. krpica i sličnog pokrovna stakalca koja prethodno moraju biti dobro očišćena od masti (24 časa u 10% kahum bihromat-sumpomoj kiselini, isprati i osušiti) i sterilizovana.

Razna razređenja dezinficijensa stavljaju se u male posudice u kojima se nalazi savinut u oblik U stakleni štapić na koji se naslanjaju radi lakšeg vađenja pokrovna stakalca. Posle vađenja u određenim vremenskim razmacima iz dezinfekcionog rastvora pokrovna stakalca se dva puta ispiru u sterilizovanoj vodi. Za izvođenje ovog ispitivanja traži se temperatura od 20° C.

Metoda prema Reddish-u sastoji se u tome da određenu vrstu bakterija dobro pomešamo sa rastvorenim agarom u Petrijevoj šolji. Nakon što se agar skmtne u sredini šolje izreže se i izvadi u obliku kruga deo agara. Na to mesto stavlja se određena koncentracija rastvora sredstva. koje ispitujemo (u dmgu šolju meće se đruga koncentracija rastvora) Petrijeva šolja se sada 24 časa inkubira u termostatu. Dezinficijens koji smo stavili, zavisno od količine, jakosti, vremena prodiraće u agar i u manjoj ili većoj udaljenosti oko izrezanog kmga ubijaće ili će sprečavati rast mikroorganizama. U okolini izrezanog otvora gde je potpuno ili delomično sprečeno rastenje kolonija pojavljuje se tamnija zona.

Sem naveđenih metoda vrlo često se koristi metoda direktnog izlaganja suspenzije buljonske kulture uticaju dezinficijensa. U tu svrhu iz buljonske kulture sa fiziološkim rastvorom priprema se homogena suspenzija. Ovu dodajemo direktno u razna razređenja rastvora sredstva koje ispitujemo. Sadržaj se pri tom dobro promućka kako bi se pospešio što prisniji kontakt rastvora i mikroorganizama. Sada se u određenim vremenskim razmacima uzima iz ovog rastvora manja količina materijala kojim se zasejava veća količina buljona, koji zatim inkubiramo kroz 24—48 časova u termostatu i proveravamo da li postoji rast bakterije. Veće količine buljona potrebno je uzeti zato da bi se što više razredio dezinficijens koji je unešen sa materijalom kod zasejavanja i da se na taj način izbegne produžno delovanje dezinficijensa.

Za tačnije dobijanje rezultata pre samog zasejavanja na buljon treba sa bakterija eliminisati dezinficijens. To vršimo na taj način što u rastvor kome smo dodali suspenziju bakterija, nakon određenog vremena kad želimo zasejati od ovog materijala buljon, dodajemo određeno hemijsko sredstvo (vidi pre navedene metode) koje će eliminisati dezinficijens. Ovo sada centrifugiramo kod velikog broja okretaja. Sediment isperemo više puta sterilnom vodom a zatim njime zasejavamo buljon.