Pred nama se nalazi knjiga „Projektovanje procesa i uređaja u Biotehnologiji i Biohemijskom inženjerstvu“ profesora Branka Bugarskog, knjiga koja na moderan, detaljan i sveobuhvatan način obrađuje jednu kompleksnu i multidisciplinarnu oblast koja do sada nije u većoj meri bila zastupljena u domaćoj naučnoj literaturi. Knjiga daje širok uvid u osnove biotehnologije i biohemijskog inženjerstva, građu, strukturu i metabolizam ćelije kao osnovne jedinice u biotehnološkim procesima, zatim u osnove projektovanja uređaja u biotehnologiji gde je inženjerski pristup i način razmišljanja posebno naglašen, kao i u klasifikaciju i proračun različitih tipova bioreaktora koji su našli primenu u biotehnologiji i biohemijskom inženjerstvu. Odabrane oblasti koje su u knizi tretirane su izvanredno teorijski obrađene i bazirane na savremenim literaturnim izvorima i podacima. Knjiga je sistematski zrelo koncipirana, pisana jasnim, razumljivim i jezgrovitim jezikom, ilustrativno i grafički znalački potkrepljena, matematički fundirana i izložena na monografskim osnovama. Kao takva daje celovitu teorijsku i inženjersku sliku o projektovanju prcesa i uređaja u biotehnologiji.
Namenjena je pre svega studentima Tehnološko-metalurškog fakulteta koji u svom programu imaju ovaj kurs, ali će takođe biti od velike koristi i studentima ostalih fakulteta koji u svom programu tretiraju oblast biotehnologije i biohemijskog inženjerstva. Uz to smatram da će kniga svoje čitoce naći i u širokoj populaciji stručnjaka koji se u praksi bave ovom problematikom.
Uzimajući u obzir visoke naučne standarde koje ispunjava ova knjiga i atraktivnost oblasti koju tretira, nema sumnje da će ona obogatiti i osvežiti domaću izdavačku delatnost u oblasti biotehnologije i biohemijskog inženjerstva.
U Beogradu, 23. Jula 2005.
Viktor Nedović
1. Uvod
1.1. Primena biotehnologije
1.1.1. Primena biotehnologije u medicini
1.1.2. Primena biotehnologije u veterini
1.1.3. Primena biotehnologije u poljoprivredi
1.1.4. Primena biotehnologije u proizvodnji specifičnih hemikalija
1.1.5. Primena biotehnologije u proizvodnji hrane i pića
1.1.6. Osnovni pravci istraživanja novih biotehnoloških procesa
1.1.6.a. Istraživanja genoma 1.1.6.b. Istraživanja proteina I.I.6.C. Farmacija i dizajn lekova
1.2. Biohemijsko inženjerstvo
1.2.1. Podela biohemijskog inženjerstva
1.2.2. Osnovni pravci razvoja biohemijskog inženjerstva u oblasti regenerativne medicine
2. Biološki koncept
2.1. Raznovrsnost ćelija
2.2. Razvoj sojeva
2.3. Genetičko inženjerstvo
2.4. Biotehnologija eukariotskih ćelija
2.5. Struktura ćelija
2.5.1. Ćelijska membrana
2.5.2. Jedro
2.5.3. Mitohondrije
2.5.4. Citoplazmatske organele i strukture uključene u sintetske procese
2.5.5. Citoplazmatske organele i strukture uključene u procese razlaganja
2.5.6. Unutrašnji ćelijski skelet
2.6. Ćelija i njena okolina
2.6.1. Transport kroz ćelijsku membranu
2.6.2. Adhezija
2.6.3. Kontaktna inhibicija
2.6.4. Ćelijska fuzija
2.6.5. Ćelijski rast
2.6.6. Celijski ciklus
2.6.7. Regulacija rasta ćelija
2.6.8. Diferencijacija
2.6.9. Starenje i smrt ćelija
3. Projektovanje uređaja u biotehnologiji
3.1. Primena bioreaktora
3.2. Zahtevi pri projektovanju bioreaktora
3.3. Izbor tipa bioreaktora
3.4. Vrsta i osobine biokatalizatora
3.5. Metaboličko stanje ćelija
3.6. Fizikohemijske osobine medijuma
3.7. Način izvođenja procesa
3.8. Supstrati
3.9. Sterilnost i kontaminacija
3.10. Sigurnosni aspekti i regulativa: ćelijske kulture
3.10.1. Glavna banka ćelija i radna banka ćelija
3.10.2. Karakterizacija i kvantifikacija/testovi
3.11. Tim koji vrši ispitivanja
3.12. Faze bioreaktorske proizvodnje
3.12.1. Sterilisanje bioreaktora
3.12.2. Čišćenje bioreaktora
3.13. Priprema supstrata
3.14. Bioreaktorsko inženjerstvo
3.15. Obrada bioprodukata
3.16. Procesi separacije čvrsto-tečno
3.17. Procesi dezintegracije ćelija
3.18. Procesi koncentrovanja bioprodukata
3.19. Izolacija i fino prečišćavanje bioprodukata
4. Inženjerski aspekti projektovanja sistema u bitehnologiji i kinetika procesa
4.1. Osnovni principi biohemijskog inženjerstva
4.2. Kinetika sterilizacije medijuma
4.2.1. Kinetika termičke smrti mikroorganizama
4.2.1.a. Logaritamska kinetika 4.2.1 .b. Nelogaritamska kinetika
4.2.2. Uticaj temperature na kinetiku strilizacije medijuma
4.2.3. Osnovi projektovanja sistema za sterilizaciju medijuma
4.2.3.a. Šaržna sterilizacija 4.2.4.b. Kontinualna strilizacija
4.3. Kinetika šaržne kultivacije – Monodova kinetika
4.4. Kinetika enzimska reakcija kinetika
4.4.1. Značaj enzima
4.4.2. Poređenje enzima i sintetičkih katalizatora
4.4.3. Faktori koji utiču na aktivnost enzima
4.4.4. Kinetika enzimskih katalizovanih reakcija 4.5. Kinetika mikrobioloških procesa – složeniji modeli
4.5.1. Nestrukturni modeli
4.5.2. Strukturni modeli
4.5.3. Određivanje parametara koji se koriste u kinetičkim modelima u biohemijskom inženjerstvu
4.5.4. Proračun šaržnih fermentora sa mešanjem
4.5.5. Proračun kontinualnih bioreaktora sa mešanjem
4.5.6. Kontinualni bireaktori sa recirkulacijom ćelija
4.5.7. Kinetika procesa u kombinaciji reaktora i kaskade
4.5.8. Kinetika procesa sa polukontinualnim kulturama
5. Bioreaktori
5.1. Klasifikacija bioreaktora
5.2. Bioreaktori sa mehaničkim mešanjem
5.2.1. Fenomenologija procesa mešanja u laboratorijskim, poluindustrijskim i industrijskim fermentorima 5.2.l.a. Smicanje
5.2.1.b. Cirkulaciono vreme i vreme mešanja
5.2.l.c. Promena snage mešanja i brzine aeracije u toku procesa fermentacije
5.2.1.d. Strujanje gasa u industrijskom fermentoru
5.2.l.e. Uticaj geometrije raspodeljivača gasa na prenos mase u fermentoru
5.2.1.f. Merenje viskoziteta višefaznog sistema
5.2.l.g. Neutralizacija
5.2.l.h. Prenos ugljendioksida
5.2.1.i. Praćenje promena veličina u toku proizvodnog ciklusa postrojenja
5.2.2. Uticaj aeracije i mešanja na mikroorganizme
5.2.3. Potrošnja snage pri aeraciji sa mešanjem
5.2.3.a. Mešanje bez aeracije, njutnovska tečnost
5.2.3.b. Mešanje nenjutnovske tečnosti bez aeracije
5.2.3.c. Mešanje tečnosti sa aeracijom, njutnovske tečnosti
5.2.3.d. Mešanje nenjutnovske tečnosti sa aeracijom
5.2.4. Prenos kiseonika u fermentacionim sistemima
5.2.4.a. Merenje koeficijenta prenosa mase, ki^a
5.2.4.b. Prenos mase u različitim uređajima za fermentaciju
5.2.5. Osnovni principi bioreaktora sa mešanjem
5.2.6. Konfiguracija bioreaktora sa mešanjem
5.3. Bioreaktori sa pneumatskim mešanjem
5.3.1. Tipovi reaktora sa pneumatskim mešanje
5.3.2. Proračun reaktora sa barbotažom mehurova
5.3.3. Proračun pneumatskog reaktora sa cirkulacijom
5.4. Poređenje bioreaktora
5.5. Posebne projektne karakteristike
5.6. Merno-regulaciona oprema bioreaktora
5.7. Uvećanje razmera procesa (scaleup)
5.8. Bioreaktori za posebne primene
5.8.1. Bioreaktora za obradu otpadnih voda i izduvnog gasa
5.8.2. Bioreaktori za površinske kulture
5.8.3. Bioreaktori sa imobilisanim enzimima i ćelijama (imobilisani katalizatori)
5.8.3.a. Imobilizacija ćelija
5.8.3.b. Metode imobilizacije ćelija
5.8.3.c Modelovanje procesa u česticama sa imobilisanim ćelijama
5.8.3.d. Ekstruzione tehnike
5.8.3.e. Bioreaktori sa imobilisanim ćelijskim kulturama
5.8.4. Bioreaktori sa ćelijskim kulturama sisara i biljaka
5.8.5. Bioreaktori sa integrisanim izdvajanjem proizvoda
6. Hromatografske metode za prečišćavanje proteina
6.1. Jonoizmenjivačka hromatografija
6.1.1. Faze jonoizmenjivačke hromatografije
6.1.2. Analiza frakcija
6.1.3. Oprema za izvođenje hromatografije
6.1.4. Osobine jonoizmenjivačkih matriksa
6.2. Afinitetna hromatografija
6.2.1. Faze afinitetne hromatografije
6.2.2. Analiza frakcija
6.3. Gel filtracija
6.3.1. Analiza frakcija
6.4. Priprema uzoraka za hromatografiju
7. Dobra proizvođačka praksa za biofarmaceutske proizvode
7.1. Upravljanje kvalitetom
7.2. Prostorije i oprema
7.3. Dokumentacija
7.4. Proizvodnja
7.5. Kontrola kvaliteta
7.6. Proizvodnja sterilnih medicinskih proizvoda
8. Dizajn i ekonomska evaluacija procesa
8.1. Procesni simulatori
8.2. Primer dizajniranja biotehnološkog procesa – proizvodnja limunske kiseline
8.2.1. Opisprocesa
8.2.2. Materijalni bilans
8.2.3. Ekonomska evaluacija Nomenklatura
Indeksi
Literatura
1. Uvod
Prema definiciji Evropske federacije za biotehnologiju iz 1992. godine, biotehnologija „povezuje prirodne i inženjerske naučne discipline da bi se postigla primena organizama, ćelija, njihovih delova i molekulamih entiteta u dobijanju proizvoda za dobrobit čovečanstva“.
Prema toj definiciji, biotehnologija je disciplina stara koliko i tradicija pravljenja piva, vina i hrane, ali i sasvim nova i savremena sa tehnologijom na osnovi rekombinantne DNK, tehnologijom primene proizvodnjom hibridoma i drugih ćelija viših organizama, biosenzora i biočipova. Spektar proizvoda širi se svakim danom od proizvoda tradicionalne biotehnologije, kao što su pekarski kvasac, mlečni proizvodi, pivo, vino, alkohol i organske kiseline, do nekoliko stotina novih, farmaceutskih i dijagnostičkih preparata. Takođe su značajni biotehnološki postupci u zaštiti životne sredine (obrada otpadnih voda, biološka razgradnja organskoga čvrstog otpada, biodeodorizacija) i mogućnosti primene biotehnologije u agrokompleksu. Zbog izuzetnog značaja biotehnologija je 1990. godine uvrštena među 12 visoko razvijenih tehnologija koje bi trebalo da budu udarni pravci razvoja Evropske unije.
Biotehnologija se danas smatra poslednjom velikom tehničkom inovacijom dvadesetog veka. Velika pažnja koja joj se poloklanja rezultat je u velikoj meri dostignuća modeme biologije, a pre svega genetičkog inženjerstva i hemije proteina, koje su omogućile primenu savremenih inženjerskih koncepta u ovoj, inače veoma staroj oblasti Ijudske delatnosti.
Istorija biotehnologije se sažeto može opisati sledećim glavnim događajima:
Godina i događaj
- 6000. pre Hrista. Dobijanje alkoholnih pića, hleba i sira fermentacionim procesima
- 1857. Luj Paster dokazuje da je fermentacija izazvana mikroorganizmima. Izoluje kvasac i povezuje ga sa alkoholnom fermentacijom. Proučava povezanost bolesti sa dejstvima mikroorganizama.
- 1900. Početak razvoja industrijskih fermentacija. Prvi antibiotik, piokinaza, izolovan je 1901 godine iz bakterije Pseudomonas.
- 1923. Počinje industrijska proizvodnja limunske kiseline.
- 1928. Fleming otkriva penicilin, ali njegovo otkriće ne privlači gotovo nikakvu pažnju. Tek pod teškim uslovima za vreme II Svetskog rata, u traganju za antibakterijskim preparatom koji bi imao širu skalu aktivnosti od do tada korišćenih sulfo-preparata, Flori i Šejn reaktiviraju Flemingovo otkriće.
- 1944. Uspostavlja se industrijska proizvodnja penicilina za potrebe rata u Normandiji, u saradnji engleskih i američkih naučnika i inženjera. Ova proizvodnja označava početak moderne biotehnolologije pošto je nastala kao rezultat nekoliko značajnih inovacija: razvijen je 200 puta aktivniji soj, sa površinske se prešlo na submerznu kulturu, uspostavljena je masovna industrijska proizvodnja bazirana na velikim fermentorima i pratećoj opremi za pripremu i finalizaciju proizvoda. Sledilo je osvajanje industrijske proizvodnje drugih antibiotika, po već razvijenoj tehnologiji, a zatim i druge fermentacije čiji su proizvodi vitamini (B2, B12, C), kao i amino kiseline.
- 1953. Wotson i Krik otkivaju strukturu DNK. Ovo otkriće je utrlo put razvoju moderne biologije.
- 1966. Otkrivanje genetskog koda što je omogućilo hemijsku sintezu gena.
- 1973. Razvoj tehnologije rekomnbinantne DNK. Nastaje genetičko inženjerstvo kao novi alat savremene biotehnologije.
- 1982. Nastaje prvi komercijalni proizvod rekombinantne tehnologije − humaniinsulin.
- 2000 Počinje sekvencioniranje humanog gena (genom-projekat).
1.1. Primena biotehnologije
Biotehnologija se deli na tradicionalnu i novu biotehnologiju. U tabeli 1.1 data su osnovna područja razvoja biotehnologije i njeni najvažniji proizvodi u okviru ovih disciplina. U tabeli 1.2 dat je pregled važnijih industrijskih biotehnoloških procesa tradicionalne i nove biotehnologije.
Tabela 1.1. Osnovana područja razvoja biotehnologije i njeni najznačajniji proizvodi.
- MEDICINA
antibiotici vakcine hormoni imunoproteini - VETERINA
antibiotici vakcine hormoni rasta - POLJOPRIVREDA
pesticidi fungicidi herbicidi veštačko seme - BIOLOŠKI
vitamini - AKTIVNI
amino kiseline - MOLEKULI
enzimi peptidi - HRANA I PIĆE
mleko i mlečni proizvodi alkoholna pića zaslađivači
baze za sokove
aditivi
U tradicionalnoj biotehnologiji dominira proces fermentacije i ona je osnova prehrambene industrije (proizvodnja etanola, organskih kiselina, piva mleka i mlečnih proizvoda). Novom biotehnologijom dominiraju đanas procesi obrade bioprodukata, a ona je osnova farmaceutske industrije (proizvodnja antibiotika, insulina, interleukina, hormona rasta). Predviđa se da će biotehnologija budućnosti biti tehnologija zaštite životne sredine i da će biti osnova farmaceutske, biohemijske industrije, kao i zaštite životne sredine.
Treba još naglasiti da biotehnologija nije zasebna nauka, već je multidisciplinarna grana nauke, čiji je osnovni zadatak ekonomična realizacija biološkog procesa u industriji, za koje su potrebna znanja biologije, mikrobiologije, biohemije, hemije i inženjerstva.
Fermentacioni procesi sa mikroorganizmima
- Proces
- PROIZVODNJA BIOMASE
Sojevi Bacillus thuringlensis, B.penentrans Verticillum thompsoni, Hirsutella thompsol - Lactobacillus sp.
Steptococcus cremoris sp. Penicillium roquerfortil Proizvod Mikrobiološki insekticidi
Prerada mleka, jogurt, sir - PROIZVODNJA MALIH
BIOMOLEKULA
Oprimami metaboliti:
b) biotransformacije produkti metabolizma: (etanol.aceton, butanol.mlečna kiselina) osnovni metaboliti: (amino kiseline, vitamin B, nukleotidi, pigmenti)
steroidi, amino kiseline, sorboza, vitamin C antibiotici, mikotoksin, pigmenti, - PROIZVODNJA SLOŽENIJIH
BIOMOLEKULA
polisaharidi:
proteini: ksantan,
dekstran, pulan, gelan, emulsan
enzimi,interferon, interleukin,hormon rasta, urokinaza, tumorski faktor - PROCESI SA ŽIVOTINJSKIM I BILJNIM ĆELISKIM KULTURAMA
Proces Proizvod - PROIZVODNJA VAKCINA ljudske − humane vakcine
- PROIZVODNJA VAKCINA PROTIV
VIRUSA veterinarske vakcine za žuticu kunića canine hepatitis - PROIZVODNJA SKUPIH FARMAKOLOŠKIH PREPARATA eritropoetin monoklonska antitela
- PROIZVODNJA SKUPIH HEMIKALIJA kodein, atropin, mentol
BIOKATALITIČKI PROCESI
Proces - PROIZVODNJE HEMIKALIJA Proizvod
L-amino kiseline, fruktozni sirup, 6-aminopenicilanska kiselina, maleinska kiselina, aspartamska kiselina
MIKROBIOLOŠKI PROCESI U ZAŠTIT11 ‘IVOTNE SREDINE
PRERADA OTPADNIH MATERIJA
IZLUŽIVANJE METALA
U RUDARSTVU voda mulijevi
1.1.1. Primena biotehnologije u medicini
Danas je najaktivnije područje primene biotehnologije svakako dobijanje proizvoda za primenu u humanoj medicini (dijagnostici i terapiji). Ova oblast je ujedno najviše vezana za primenu rekombinantne tehnologije.
Kloniranje gena za različite antigen-proteine osnov je za sintezu viralnih proteina i dobijanje vakcina. Virusi su sačinjeni od različitih antigen − proteina koji mogu biti upotrebljeni za stimulaciju imunog sistema u cilju proizvodnje antitela. Tradicionalne vakcine se zasnivaju na stvaranju antitela, kao odgovora na prisustvo virusa (vakcine) implementiranih u organizam. Ta ista antitela napadaju i deaktiviraju eventualno prisutne žive viruse. Vakcine dobijene genetičkim inženjerstvom su jednostavno preparati sintetizovanih viralnih proteina koji na isti način stimulišu imuni sistem. Masovna proizvodnja tradicionalnih vakcina zahteva osvajanje postupaka za gajenje živih virusa, prevenciju njihovog oslobađanja u okolinu i razvoj metoda testiranja vakcine u kojoj ne sme biti živih virusa. Sinteza viralnih proteina izbegava potrebu za izolovanjem virusa, nema mogućnosti za kontaminaciju okoline, a smanjuje potrebe za testiranjem rezidualne aktivnosti vakcine. Zato se očekuje da će u budućnosti vakcine dobijene tehnologijom genetičkog inženjerstva dominirati tržištem. Od najvećeg interesa su, na primer, vakcine za hepatitis, AIDS, herpes, malariju, koleru i boginje.
Humani hormoni su druga klasa proizvoda sa kojima je ostvaren veliki tehnološki progres. Hormoni su regulatori metabolizma koje proizvode organi endokrinog sistema. Hormoni se mogu dobiti ili hemijskom sintezom (uspešna samo za najjednostavnije hormone, npr. steroide) ili ekstrakcijom iz tkiva. Insulin dobijen ekstrakcijom iz pankreasa životinja izazivao je često kod Ijudi alergijske reakcije, zbog razlika u strukturi između humanih i životinjskih hormona. Genetičko inženjerstvo je ponudilo nov i neograničen izvor za dobijanje hormona, među kojima su insulin, hormon rasta (HGH) i plasminogen aktivator (TPA, sprečava emboliju i stoga se koristi u terapiji srčanih i koronarnih bolesti).
Spečificni lekovi čije je dobijanje zasnovano na primeni genetičkog inžinjerstva obuhvataju interferon (alfa, beta i gama), interleukine i limfotoksin. Veliki značaj ovih lekova vezan je za njihovo stimulatomo dejstvo na imuni sistem i potencijal u terapiji kancerogenih bolesti i opštih infekcija.
1.1.2. Primena biotehnologije u veterini
Postoji značajna sličnost pojedinih oblasti u veterinarstvu sa humanom medicinom. Sve što je rečeno o vakcinama za primenu u humanoj medicini važi i za vakcine koje se koriste za lečenje životinja. Genetičko inženjerstvo je do sada ponudilo vakcine nove generacije za više bolesti krupne stoke, svinja i živine. Hormoni su od potencijalno najvećeg tržišnog značaja, s obzirom da se ne koriste samo za terapiju (kao u humanoj medicini), nego prevashodno i za ubrzanje rasta životinja, povećanje proizvodnje mleka i poboljšanje kvaliteta mesa.
1.1.3. Primena biotehnologije u poljoprivredi
Hemikalije za primenu u poljoprivredi predstavljaju još jedno veliko tržište za biotehnologiju. Glavni motiv za prelaz na hemikalije dobijene metodama modeme biotehnologije je zamena klasičnih pesticida, herbicida i fungicida za koje je utvrđeno da su kancerogeni, a neosporno je da ugrožavaju okolinu (dugotrajno zagađenje voda i tla).
U ovoj oblasti se primenjuju različite strategije, kao na primer: (a) ekspresija bakterijskih gena direktno u biljkama, tako da one proizvode supstance toksične za insekte iili stiču herbicidnu otpornost; (b) promena mikrookoline biljaka unošenjem u tlo bakterija sa biopesticidnim genima.
1.1.4. Primena biotehnologije u proizvodnji specifičnih hemikalija
U kategoriju specifičnih hemikalija može se uvrstiti široka skala proizvoda, od hemijskih intermedijera do bioloških katalizatora, a najznačajniji proizvodi su: vitamini, amino kiseline i enzimi koji se dobijaju uglavnom fermentacijom uz upotrebu specifičnih mikroorganizama. Za vitamine se pri tome koristi ili kombinacija hemijskih i biohemijskih postupaka (C vitamin) ili fermentacija (B2, B12). Amino kiseline se, izuzev metionina, dobijaju fermentacijom, a koriste se kao dodaci za hranu ili kao biološki aktivne supstance. Na primer, dodatkom lizina kukuruzu koji je diferenciran u lizinu za ishranu stoke, povećava se njegova prehrambena vrednost, pošto dolazi do potpunog metaboličkog iskoriščenja. Metionin, lizin i triptofan su tri amino kiseline koje se proizvode u najvećim količinama. Ovom proizvodnjom na svetskom nivou (450,000 tona od 1992 god. sa godišnjim rastom od 4 − 10% do 2002 godine) dominira Japan. Interesantno je i da ove sintetičke amino kiseline učestvuju u ukupnoj svetskoj proizvodnji amino kiselina sa 1 % po količini, ali sa čitavih 18% po tržišnoj vrednosti.
Enzimi imaju ogroman komercijalni značaj i proizvode se za primenu u proizvodnji deterdženata (proteaze), bistrenju piva i voćnih sokova, prevođenju skroba u fermentabilne šećere (glukoamilaze, alfaamilaze), za dobijanje alkohola kao i dobijanje fruktoznog sirupa (glukoza izomeraza) u proizvodnji sira (renin) itd. Renin je trenutno najpogodniji enzim za prelazak na rekombinantnu tehnologiju proizvodnje, zbog velike potrebe za ovim enzimom, ali i činjenice da je jedini metod za njegovo dobijenje ekstrakcija iz životinja.
1.1.5. Primena biotehnologije u proizvodnji hrane i pića
Proizvodnja alkoholnih pića je ogromna po količinama i odvija se klasičnim tehnologijama u koje se veoma sporo probijaju inovacije vezane za unapređivanje soja ili tehnologije. O zaslađivačima se manje zna, mada od 1970. godine doživljavaju ogromnu ekspanziju i smatraju se velikim uspesima biotehnološke proizvodnje, posebno fruktozni sirup i veštački zaslađivači (aspartam, 200 puta slađi od šećera). Proteini iz jednoćelijskih organizama, naprotiv, nikada nisu bili prihvaćeni na tržistu iz psiholoških razloga, ali i zbog soje kao altemativnog izvora proteina niske cene.
1.1.6. Osnovni pravci istraživanja novih biotehnoloških procesa
Pravci istraživanja u savremenoj biotehnologiji su veoma raznovrsni i dostignuća iz ove oblasti počinju da nalaze svoju primenu u najrazličitijim sferama nauke i svakodnevnog života. Ipak, istraživanja koja u ovom trenutku privlače najveću pažnju i koja su najatraktivnija, kako za javnost, tako i za privlačenje kapitalnih investicija su istraživanja genoma i proteina (prvenstveno Ijudskih) sa ciljem primene u medicini radi razvijanja novih lekova i terapija. U ta istraživanja spadaju proučavanje kompletnih genorna, proučavanje proteina i pronalaženje proteinskih targeta za lekove i na kraju, praktična primena tako dobijenih rezultata ostvarena kroz sintezu lekova.
1.1.6. a. Istraživanja genoma
Izraz genom (genomics) prvi put je upotrebio genetičar Tom Roderik (Tom Roderick) 1987 godine da bi opisao pristup proučavanju DNK na nivou hromozoma, celih genoma ili velikih grupa gena. Ovaj prispup se u velikoj meri razlikovao od dotadašnjeg pristupa proučavanju DNK. koje se uglavnom odvijalo na nivou pojedinačnih gena. U okviru ovih istraživanja vrše se sistematska ispitivanja genoma, odnosno kompletnog hromozomskog seta određenog organizma. U današnje vreme takva istraživanja podrazumevaju kreiranje i upotrebu velikih baza podataka i adekvatnu laboratorijsku opremu i samim tim, velika ulaganja. Postoje dva aspekta istraživanja genoma − strukturni i funkcionalni.
• Strukturna ispitivanja predstavljaju određivanje sekvence DNK i mapiranje gena.
• Funkcionalna istraživanja su usmerena na ispitivanje funkcionalnih aktivnosti utvrđenih genetičkih sekvenci. Kako se bude privodilo kraju iščitavanje Ijudskog genoma, tako će se i težiste rada pomerati sa strukturnih prema funkcionalnim aspektima istraživanja, sa ciljem dobijanja rezultata konkretno primenljivih u praksi.
1.1.6. b. Istraživanja proteina
Identifikacija svih proteina u ćelijama i analiza njihovih interakcija predstavlja trenutno jedno od najatraktivnijih polja u biotehnološkoj industriji, kako u velikim kompanijama tako i kod kompanija u osnivanju. Naziv proteom nastao je tek 1994. godine kada ga je Mark Vilkins (Willkins), doktorant na Univerzitetu u Sidneju, prvi put upotrebio da bi opisao skup svih Ijudskih proteina. Proteini predstavljaju „radnu snagu“ ćelije i metu za potencijalne lekove. Međutim, identifikacija i sekvencioniranje gena ne obezbeđuju u ovom trenutku dovoljno podataka za razvoj novih terapija. Tako je razvijena nova oblast istraživanja „proteomics“ koja se bavi istraživanjem strukture proteina i njihovih međusobnih veza. Ova oblast postaje sve atraktivnija za investiranja. Samo od juna 2000. do oktobra 2001 godine više od 700 miliona dolara investitorskog kapitala uloženo je u firme koje se bave ispitivanjem proteoma.
Posle objavljivanja prve potpune analize Ijudskog genoma biomedicinska istraživanja će se skoro u potpunosti prebaciti sa genomics-& na proteomics kao ključne tehnologije za transformaciju informacija u farmaceutske proizvode. Potreba za unapređenjem brzine i efikasnosti pronalaženja novih lekova će biti primama vodilja u okviru ovih istraživanja. Trenutne metode postepenih i hemijski optimizovanih metoda su vremenski duge (u proseku 10-12 godina da bi se otkrio novi lek) i skupe (u proseku 500-750 miliona US dolara). Takođe, postoji veliki procenat neuspešnosti prilikom kliničkog testiranja usled toksičnosti ili niske efikasnosti potencijalnih novih lekova, što rezultuje u sve većem interesovanju za biomarkere pogodne za korišćenje kod terapeutskog planiranja i dizajniranja personalizovanih lekova.
Za proteomsku industriju predviđa se rast sa 565 miliona US dolara u 2001 godini, na preko 3.3 milijarde US dolara u 2006 godini. Ovo predstavlja prosek godišnjeg rasta od 40% i očekuje se da će potražnja za proteomičkim proizvodima biti velika tokom ovog vremenskog perioda. Očekuje se da će stopa rasta u ovom tržišnom segmentu početi da opada posle 2005 godine kada sledeća generacija proteomičkih proizvoda bude izbačena na tržište.
1.1.6. c. Farmacija i dizajn lekova
Na osnovu informacija dobijenih u okviru genomskih i proteomskih istraživanja u toku narednih deset godina očekuje se značajan napredak u farmaceutskoj industriji. Određivanje targeta za lekove u okviru proteomskih ispitivanja dovelo bi do znatnog napretka i kreiranja takvih lekova, koji bi blokirali tačno one proteine koji prouzrokuju određene bolesti. Pored poboljšanja u laboratorijskim ispitivanjima očekuje se takođe i ubrzavanje procedure izvođenja novih lekova na tržište. Budući da je ovaj proces trenutno veoma spor i skup, to bi farmaceutskim kompanijama u velikoj meri umanjilo troškove. Stotine miliona dolara se godišnje troši na istraživanje i razvoj novih lekova. Pri tome, samo jedno od hiljadu eksperimentalnih jedinjenja prođe preklinička ispitivanja, a jedan od pet klinički ispitanih lekova stiže na tržište.
Dobijanje konkretnih informacija iz pročitanog genetičkog koda i otkrivanje ćelijskih mehanizama koji dovode do stvaranja određenih patoloških stanja ili pojave bolesti (naročito kada su u pitanju nasledne bolesti), moglo bi da bude teorijska osnova za dizajn novih, usko specificnih lekova koji bi bili u skladu sa genetičkim kodom pojedinca i samim tim, neuporedivo efikasniji od postojećih lekova. Postoje prognoze da bi plasman ovakvih lekova na tržište mogao uvećati prihode farmaceutskih kompanija do 50 i više procenata.
1.2. Biohemijsko inženjerstvo
Biohemijsko inženjerstvo se formira sa počecima razvoja moderne biologije, kada je (posle matematike, fizike i hemije) ova izvedena nauka počela da dobija obrise savremene kvantitativne nauke izdavajajući se iz “opštosti biotehnologije” spremne za primenu egzaktnih inženjerskih pristupa. Ova oblast integriše biološke principe sa termodinamikom, fenomenima prenosa, konceptima reaktorskog inženjerstva i separacionih procesa i u velikoj meri preuzima „alate“ hemijskih inženjera kojima se oni služe u analizi i projektovanju opreme i procesa.
Definicija biohemijskog inženjerstva
U preseku skupova biologije, hemije i fizike kao osnovnih nauka, nalaze se izvedene tehničke discipline kao što se biotehnologija, biohemijsko inženjerstvo i hemijsko inženjerstvo neophodne za industrijsku realizaciju bioprocesa (Slika 1.1.)
Slika 1.1. Biohemijsko inženjerstvo kao izvedena naučna disciplina.
Izostavljeno iz prikaza
Prema definiciji “Biohemijsko inženjerstvo je primena inženjerstva, odnosno uže hemijskog inženjerstva, na biološke i biohemijske procese i u tom je kontekstu, kao i biohemija ili mikrobiologija, posebna naučna disciplina koja se nalazi na granici između biologije, fizike i hemije”.
Za razliku od klasičnih disciplina, kao što je npr. fizička hemija, biohemijsko inženjerstvo je multidisciplinarno, a i granično područje u koje zadiru biologija, hemija, fizika kao i matematičko modelovanje, odnosno opisivanje i predviđanje fenomena korišćenjem matematičkog formalizma.
Zadatak biohemijskog inženjerstva je da teorijski defmiše pojedine tehnološke operacije u biotehnologiji (npr. mešanje, aeraciju, filtraciju, sušenje) kao i sam proces, da bi se na temelju tog opisa moglo projektovati i vršiti selekcija aparata i uređaja u kojima će se proces industrijski izvoditi na najekonomičniji način. Svrha biohemijskog inženjerstva je primena znanja iz više naučnih disciplina koja će omogućiti razumevanje i analizu celog tehnološkog procesa na osnovu čega će se biološki procesi razvijati i racionalno sprovoditi u industriji.
Inženjerska analiza biološkog procesa zahteva razvoj kvantitativnog matematičkog prikaza procesa na osnovu njegovog kvalitativnog-fenomenološkog razumevanja. Često su ti prikazi, koje nazivamo matematičkim modelima, samo vrlo pojednostavljene i idealizovane slike stvamih zbivanja u biološkim procesima, ali neophodni pri razvoju i projektovanju industrijskog procesa. Tako npr. za izračunavanje optimalnih uslova industrijskih bioloških procesa treba poznavati veliki broj parametara u živoj ćeliji koji kontrolišu određeni metabolitički put. Te je parametre, međutim, ponekad nemoguće eksperimentalno odrediti i zato ih je na osnovu matematičkog modela potrebno predvideti.
Prema tome, za razvoj biotehnologije nije dovoljno poznavati samo molekulsku strukturu biološkog sastava i otkriti mogućnosti biološkog materijala, već treba znati i ekonomično realizovati biotehnološke procese u industriji, a za to su potrebna znanja i metode kojima raspolaže biohemijsko inženjerstvo.
Osnova biohemijskog inženjerstva su pristupi na kojima se temelji hemijsko inženjerstvo, koje se naročito razvijalo poslednjih 40 godina uz ubrzani razvoj velikih hemijskih industrija. Prema tome, može se pojednostavljeno reći da je biohemijsko inženjerstvo primena hemijskog inženjerstva na biološke procese.
Biološki materijali su vrlo složeni, a njihova se posebnost ogleda u karakteristikama biohemijskih reakcija u biološkim procesima. Osnovna karakteristika ovih procesa je da se mogu odvijati u »fiziološkim uslovima«, odnosno pri normalnom pritisku, temperaturi od 2050°C, pH oko 7 i u vrlo razređenim, uglavnom vodenim rastvorima u kojima se postiže relativno mala produktivnost.
Sa jedne strane, ovi uslovi predstavljaju prednost u odnosu na hemijske procese, jer nisu potrebne mere sigumosti zbog visokih pritisaka i temperatura. Sa druge strane, to je nedostatak, jer se ti parametri moraju kontrolisati sa vrlo velikom tačnošću usled uskog područja u kojem je biološki materijal stabilan. Te posebnosti biloških svojstava dovele su do različitosti hemijskog i biohemijskog inženjerstva koje su vezane za karakteristike reaktorskog medijuma, uslove rada bioloških procesa, obradu bioprodukata, merenje, regulaciju i vođenje procesa.
U biohemijskom inženjerstvu se kao poseban problem nameću specifična reološka svojstva reakcionog medijuma i fenomen rasta biomase kome mora biti prilagođen bioreaktor. Mešanje u bioreaktoru mora biti prilagođeno, zavisno od osetljivosti ćelijske vrste na tangencijalne napone.
Drugi problem biohemijskog inženjerstva je uzimanje uzoraka i merenje parametara reakcionog medijuma u sterilnim uslovima, kako u laboratorijskom, tako i u poluindustrijskim i industrijskim razmerama.
Može se zaključiti da usled prisutnosti ćelija kao biološkog materijala, biotehnološki procesi imaju posebne karakteritike (Tabela 1.3.) po kojima se rezlikuju od hemijskotehnoloških procesa.
Tabela 1.3. Karakteristike biotehnoloških procesa
- Reakcioma smeša složena reologija
- fenomen rasta biološkog materijala mala mehanička čvrstoća temperatuma osetljivost
- Uslovi rada
- sterilnost
- efikasan dovod kiseonika
- Merenje i kontrola procesa
- specifični senzori
Obrada bioprodukata izdvajanje biomase(medijum) ili izdvajanje proizvoda iz ćelije specifičnim separacionim tehnikama
1.2.1. Podela biohemijskog inženjerstva
Danas se obično biohemijsko inženjerstvo deli na (Tabela 1.4.): inženjerstvo fermaceutskih procesa (uvek sterilni uslovi, ćelija se posmatra kao mali bioreaktor koji reprodukuje sam sebe ili u kojem se proizvode druge biološki aktivne supstance, a procesi tog tipa u industriji su uglavnom diskontinualni), inženjerstvo enzimskih procesa (uslovi mogu biti sterilni ukoliko se radi o prizvodnji enzima i nesterilni, ako se enzim koristi kao biokatalizator kao na primeru hidrolize masti ili transesterifikacije u prehrambenoj industriji) i ekološko inženjerstvo (gde su uslovi procesa biološkog prečišćavanja otpadnih voda nesterilni, a procesi se izvode uglavnom kontinualno).
Tabela 1.4. Podela biohemijskog inženjerstva
Izostavljeno iz prikaza
- INŽENJERSTVO FARMACEUTSKOG PROCESA
- INŽENJERSTVO ENZIMSKIH PROCESA
- EKOLOŠKO INŽENJERSTVO
uslovi procesa sterilni apirogeni
uslovi procesa
sterilni (prizvodnja enzima), nesterilni (biokataliza)
uslovi procesa nesterilni
ćelija: bioreaktor i proizvod
ćelija ili čist enzim:
biokatalizator ćelija:
reaktor
U osnovi, svaki bitehnološki proces obuhvata tri faze: pripremu supstrata, proces u bioreaktoru (biokonverzija, kinetika rasta i nastajanje proizvoda, CIP − čišćenje in situ, SIP − sanitacija in situ) i obradu bioprodukta.
Ekonomičnost celog biotehnološkog procesa, koja će u nastavku knjige biti detaljnije razmatrana, veoma zavisi od procesa obrade bioprodukta i zato se čine veliki napori da se procesi u bioreaktoru integrišu sa procesima obrade bioprodukta i na taj način poveća produktivnost biotehnološkog procesa, a time i njegova ekonomičnost.
Biohemijsko inženjerstvo je uključeno u razvoj celokupnog biotehnološkog procesa tako da je teško precizno razdvojiti domen biohemijskog inžinjerstva od domena biotehnologije. Pojednostavljeno, biotehnologija kao starija disciplina obuhvata (bio)tehnološke »recepture«, dok biohemijsko inženjerstvo primenjuje inženjerske alate projektovanja (prenos mase, toplote i količine kretanja) na konkretne slučajeve u biološkim sistemima.
1.2.2. Osnovni pravci razvoja biohemijskog inženjerstva u oblasti regenerativne medicine
Biohemijsko inženjerstvo u oblasti medicine zasniva se na gajenju in vitro kulture tkiva: mikroinkapsulacija i bioreaktorska kultivacija. Istraživanja in vitro kultivacije funkcionalnih tkiva baziraju se na autolognim ćelijama. Razvijaju se nove metode za imobilizaciju/inkapsulaciju bazirane na novim biokompatibilnim biomaterijalima. Projektuju se novi bioreaktori koji pored kontrole mirookoline obezbeđuju: stacioname uslove kultivacije, efikasan transport mase i toplote do kulture tkiva, kao i adekvatne fluidodinamičke zahteve, a omogućavaju i primenu biomehaničkih i električnih signala u sistemu.